探討雷公藤甲素對BALB/c哮喘小鼠IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸的影響①

楊志明　成俊芬陳鳴娣梁一波(肇慶市第一人民醫院，肇慶526020)

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探討雷公藤甲素對BALB/c哮喘小鼠IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸的影響①

楊志明成俊芬②陳鳴娣②梁一波②(肇慶市第一人民醫院，肇慶526020)

［摘要］目的:觀察雷公藤甲素對哮喘小鼠IL-23、Th17細胞及其細胞因子IL-17表達的情況，探討其對Th17細胞介導的哮喘氣道炎癥的影響及其作用機制，為雷公藤甲素治療哮喘提供作用靶點。方法: SPF級BALB/c小鼠32只，隨機分為正常組(NC組)、哮喘組(A組)、哮喘雷公藤甲素干預組(TA組)和哮喘地塞米松干預組(DA組)，每組8只。哮喘組以卵白蛋白和氫氧化鋁致敏;卵白蛋白滴鼻吸入激發。雷公藤甲素干預組及地塞米松干預組致敏及激發方法均同哮喘組，這兩組在每次激發前30 min分別予腹腔注射雷公藤甲素及地塞米松，正常對照組致敏與激發均以生理鹽水代替。細胞計數器計算肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數及嗜酸性粒細胞的數目;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠BALF IL-23，IL-17的含量; HE染色觀察小鼠肺組織病理變化;免疫組化法檢測肺組織IL-17蛋白表達水平; qRT-PCR檢測右肺組織中IL-17mRNA的表達;流式細胞儀檢測外周血Th17細胞占CD4+T淋巴細胞百分率。結果:哮喘組肺泡灌洗液(BALF)中白細胞(WBC)、嗜酸性粒細胞(Eos)、IL-23、IL-17的含量、肺組織中IL-17蛋白及IL-17 mRNA表達、外周血Th17細胞占CD4+T細胞的比率均高于對照組(P＜0.05)，雷公藤甲素干預組和地塞米松干預組中上述各指標低于哮喘組(P＜0.05) ;雷公藤甲素干預組與地塞米松干預組上述各指標間差異無顯著性(P＞0.05)。結論:雷公藤甲素可抑制哮喘氣道炎癥，其作用機制可能通過抑制IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸實現。

［關鍵詞］雷公藤甲素;哮喘; Th17細胞; IL-23; IL-17

①本文為廣東省科技計劃項目(No.2012B031800446)。

②廣東醫學院第二附屬醫院，湛江524003。

To explore effects of triptolide on IL-23/Th17(IL-17) inflammatory axis in asthmatic BALB/c mice

YANG Zhi-Ming，CHENG Jun-Fen，CHEN Ming-Di，LIANG Yi-Bo.The First People's Hospital of Zhaoqing City，Zhaoqing 526020，China

［Abstract］Objective: To observe the effect of triptolide on asthmatic mice IL-23，Th17 cells and their cytokine IL-17 expression，and to explore its effect on Th17 cell-mediated airway inflammation，and its mechanism of action，which provides targets for triptolide in treatment of asthma.Methods: 32 SPF level BALB/c mice were randomly divided into normal control group(NC)，asthmatic group(A)，triptolide group(TA group) and dexamethasone group(DA group)，n=8.Asthmatic group with ovalbumin sensitization and aluminum hydroxide; ovalbumin intranasal inhalation challernge.Mice of triptolide group and dexamethasone group were sensitized and challenged as asthmatic group，and the two groups were respectively given triptolide and dexamethasone by intraperitoneal injection 30 minutes before challenged.Mice of control group was sensitized and challenged by saline.The total number of white blood cells and the number of eosinophils of BALF were calculated by cell counter.IL-23 and IL-17 levels in BALF were measured by ELISA.Lung tissue were stained with hematoxyin and eosin(HE) .IL-17 protein expression levels were detected by immunohistochemistry in lung tissue，and the mRNA expression levels of right lung tissue were detected by qRT-PCR.Th17 percentage of CD4+T lymphocytes were analyzed by flow cytometry.Results: Numbers of white blood cells(WBC) and eosinophils(Eos) of BALF，IL-23 and IL-17 levels of BALF，IL-17 protein and IL-17 mRNA expression in lung tissue，and Th17 cell frequencies in peripheral blood were all significantly increased in the asthmatic group compared to the control group(P＜0.05)，but reduced significantly in triptolide group and dexamethasone group compared to asthmatic group; there was no significant difference in the above mentioned indicators between in triptolide group and dexamethasone group(P＞0.05) .Conclusion: Triptolide can inhibit airway inflammation，which mechanism is possible by inhibiting IL-23/ Th17(IL-17) inflammatory axis.

［Key words］Triptolide; Asthma; Th17 cells; IL-23; IL-17

支氣管哮喘是由多種細胞包括氣道的炎癥細胞和結構細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。在支氣管哮喘免疫-炎癥學說機制方面，目前普遍認為，Th2型占優勢的Th1/Th2型免疫應答失衡，是支氣管哮喘慢性氣道炎癥形成的基礎。然而，Th1/Th2型免疫應答失衡不能完全解釋哮喘的一些臨床及病理生理現象。最近發現Th17細胞及效應細胞因子IL-17在哮喘特別是重癥哮喘的發病中起著重要作用，可介導嗜酸性粒細胞及中性粒細胞性氣道炎癥，同時在氣道高反應性、氣道重塑中發揮重要作用。研究表明，IL-17受體基因敲除的小鼠在OVA激發后氣道內嗜酸性粒細胞浸潤減輕、氣道高反應性減弱并伴隨Th2型細胞因子IL-4、IL-5水平下降［1］。Wakashin等［2］通過繼轉移實驗發現，抗原特異性Th17細胞被轉移到致敏小鼠身上，Th17細胞就能顯著增強抗原誘導嗜酸性氣道炎癥。IL-23是IL-12家族的其中一員，IL-23對維持Th17細胞穩定和促進Th17細胞增殖有重要作用［3］，從而構成IL-23/ Th17(IL-17)炎癥軸系。研究表明，L-23/Th17(IL-17)在哮喘的發生發展起重要作用，能促進嗜酸性粒細胞性氣道炎癥及中性粒細胞性氣道炎癥。

雷公藤甲素(Triptolide TL，又叫雷公藤內酯醇)是從雷公藤中分離出來的二萜類化合物，是雷公藤中抗炎和免疫調節的重要有效成分。自1987年來茶云［4］等首次報道應用雷公藤多甙治療重型、偏重型小兒支氣管哮喘之后，掀開了對雷公藤多甙等雷公藤提取物在哮喘病防治方面的基礎、臨床研究的序幕。大量研究表明，雷公藤及其提取物可抑制哮喘慢性炎癥的發生。目前關于雷公藤及其提取物對Th17細胞及其效應細胞因子影響的研究報道甚少。Wang等［5］體外細胞研究發現，雷公甲素可抑制Th17細胞的分化，隨后王敏等［6］體外研究也得到類似的結果。然而關于雷公藤制劑也是否能抑制哮喘患者或哮喘模型體內Th17細胞的分化以及其效應細胞因子IL-17，此類的研究目前尚未見報道。本研究通過建立BABL/c哮喘模型小鼠，觀察雷公藤甲素對IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸系的影響，探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠32只，體重18～22 g(廣東醫學院實驗動物中心提供)飼養于符合SPF級實驗動物環境中，喂養不含致敏原的飼料及純凈水。

1.2分組隨機分為正常對照組(NC組)、哮喘組(A組)、哮喘雷公藤甲素干預組(TA組)和哮喘地塞米松干預組(DA組)，每組8只，分籠飼養。

1.3主要試劑與設備卵白蛋白(OVA美國Sigma，純度＞98%) ;氫氧化鋁粉末(廣東光華化學廠有限公司) ;地塞米松注射液(廣州僑光制藥廠) ;雷公藤甲素(Triptolide廣州牌牌生物有限公司，純度＞99.78%) ; Anti-IL-17 bs-1183R(北京博奧森生物技術有限公司) ; Mouse IL-17 ELISA Kit 96T(上海勁馬設備有限公司) ; IL-17 PCR引物(上海生工生物工程有限公司) ;抗小鼠單克隆抗體mAb-anti-CD4－FITC、anti-IL-17-PE及其相匹配的同型對照(均購自eBioscience公司) ; LightCycler 480 II實時定量PCR儀(瑞士Roche公司) ; FACS流式細胞儀(美國BD公司)。

1.4試驗方法

1.4.1哮喘模型的建立參照沈華浩［7］的《支氣管哮喘小鼠模型應用評價》進行模型制備，哮喘模型于實驗的第0、7、14天腹腔注射400 μl致敏液(含OVA 50 μl，Al(OH)31 mg)致敏;第21天起均給予2 mg/ml OVA-NS溶液滴鼻吸入激發，每天1次，連續激發5 d。雷公藤干預組及地塞米松干預組致敏及激發方法均同哮喘組，在每次激發前30 min雷公藤干預組給予腹腔注射雷公藤甲素40 μg/kg進行干預，地塞米松干預組給予腹腔注射地塞米松2 mg/kg進行干預［5］。正常對照組致敏與激發均以生理鹽水代替。

1.4.2 BALF的收集處理最后1次激發后24 h內處死小鼠，對小鼠行氣管插管，在左主支氣管處結扎左肺，用1.5 ml生理鹽水分3次灌洗右肺，回收液體量＞80%為合格，約1.0 ml/鼠，4℃，1 500 r/ min，離心10 min，收取各組細胞上清液，－80℃保存待測，取沉渣用血細胞計數板進行細胞計數，細胞分類計數。

1.4.3 BALF上清中細胞因子的檢測IL-17的測定采用小鼠ELISA試劑盒，按說明書進行操作，根據光密度值(A)計算含量。

1.4.4肺組織病理切片切取小鼠左肺組織，多聚甲醛固定液中固定。常規取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態、氣道上皮損傷情況、氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞浸潤情況。

1.4.5免疫組織化學檢測IL-17蛋白的表達水平

常規石蠟切片，脫水，吹干。PBS洗3次，每次5 min，3%H2O2室溫孵育10 min，正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗IL-17抗體(1∶100)，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min，滴加生物素化羊抗兔IgG，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次共5 min，DAB顯色，常規脫水，透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗做陰性對照，結果為陰性。光鏡下肺組織中出現棕褐色產物為陽性反應。背景為藍色。顯微鏡下隨機選取5個視野，計算每個視野陽性細胞平均數。

1.4.6逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IL-17mRNA表達采用Trizol試劑提取右肺組織總RNA，逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板行PCR擴增。目的基因引物序列: IL-17(PCR產物為123 bp)上游引物: 5'-ACTACCTCAA CCGTTCCAC-3'，下游引物: 5'-GCTTTCCCTCC GCATT-3'，退火溫度為56.9℃。β-actin上游引物: 5'-CATCCGTAAAGACCTCTAGCCAAC-3'。下游引物: 5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'，退火溫度為56℃。比較IL-17與β-actin的相對吸光度值并進行半定量分析。

1.4.7流式細胞檢測外周血Th17細胞摘除小鼠眼球取得外周血1 ml，肝素化處理，分離外周血單個核細胞，加入適當的佛波酯、離子霉素和莫能菌素液，置于50 ml/L CO237℃孵育箱培養5 h，加入抗小鼠mAb-anti-CD4－FITC 0.5 μl、anti-IL-17-PE 2.5 μl及其相匹配的同型對照，室溫避光孵育30 min，經PBS液洗滌2次后，用0.1%的多聚甲醛500 μl重懸細胞，避光4℃保存24 h內上機，檢測Th17細胞占外周血CD4細胞的比率。CellQuest軟件分析Th17細胞和CD4細胞內IL-17的表達比率。

1.5統計學分析應用SPSS19.0統計軟件，計量資料以x ±s表示，在方差齊性的基礎上，行完全隨機設計的多個樣本均數比較采用χ2檢驗;組數兩兩比較采用LSD-t檢驗。用簡單直線相關分析探討兩因素之間相關關系和程度。a = 0.05，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組肺泡灌洗液白細胞及嗜酸性粒細胞的計數哮喘組中白細胞總數及嗜酸性粒細胞計數均高于其他三組，P＜0.05，差異有統計學意義，雷公藤甲素干預組及地塞米松干預組白細胞數及嗜酸性粒細胞數均較對照組高，P＜0.05。雷公藤甲素干預組與地塞米松干預組上述各指標間差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 BALF中細胞因子IL-17、IL-23測定哮喘組IL-17、IL-23較對照組增高，P＜0.05，差異有統計學意義;雷公藤甲素干預組與地塞米松干預組較哮喘組低，較對照組偏高，P＜0.05，差異均有統計學意義。雷公藤甲素干預組及地塞米松干預組比較，P＞0.05，差異無統計意義。見表2。

表1　各組肺泡灌洗液白細胞與嗜酸性粒細胞數Tab．1 Numbers of total leukocyte and eosinophils in BALF

圖1　各組小鼠肺組織病理切片(HE，×200)Fig．1 　Molphological changes in lung tissue among different group(HE，×200)

2.3肺部病理左肺組織病理可見:正常對照組小鼠肺組織細支氣管和肺泡結構清晰，細支氣管纖毛整齊，管腔完整，血管、肺泡腔、肺間質未見炎癥細胞浸潤，基底膜較薄，氣管未見黏液痰栓(圖1A) ;哮喘小鼠細支氣管黏膜上皮脫落，氣管柱狀上皮及杯狀細胞增生明顯，氣管周圍見大量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤，部分小支氣管見痰栓形成(圖1B)。雷公藤甲素治療組(圖1C)及地塞米松干預組(圖1D)氣管周圍及肺泡炎癥細胞浸潤較哮喘組減輕，氣管柱狀上皮細胞及杯狀細胞增生亦較哮喘組減輕，但仍較正常對照組明顯。

2.4肺組織中IL-17蛋白的表達各組小鼠肺組織切片免疫組織化學反應后均可見IL-17陽性反應的細胞，在顯微鏡下表現為棕黃色顆粒沉著: IL-17主要表達在支氣管以及血管周圍淋巴細胞等細胞胞核中(圖2A～D)，與對照組(圖2A)比較，哮喘組(圖2B)陽性細胞數明顯增多，表達增高(P＜0.05) ;雷公藤甲素(圖2C)及地塞米松干預組(圖2D)較哮喘組陽性細胞數有所下降，差異有統計學意義，P＜0.05)。見圖2，表2。

2.5肺組織中IL-17 mRNA表達水平哮喘組IL-17 mRNA表達較對照組增高，P＜0.05，差異有統計學意義;雷公藤甲素干預組與地塞米松干預組較哮喘組低，但仍較對照組偏高，P＜0.05，差異有統計學意義。雷公藤甲素干預組及地塞米松干預組比較，P＞0.05，差異無統計意義。見表2。

2.6小鼠外周血Th17細胞占外周血CD4+T細胞的比率哮喘組外周血Th17細胞占外周血CD4+T細胞的比率較對照組增高，P＜0.05，差異有統計學意義;雷公藤甲素干預組與地塞米松干預組較對照組比較，P＜0.05，差異無統計學意義。雷公藤甲素干預組及地塞米松干預組比較，P＞0.05，差異無統計意義。見表2。流式圖見圖3。

Note: A.NC group; B.A group; C.TA group; D.DA group.

表2　各組IL-17、IL-17光密度值%、IL-17mRNA、Th17%及IL-23表達量比較Tab．2 Comparison of IL-17，IL-17AOD，IL-17 mRNA，Th17% and IL-23 expression among different group

表3　哮喘組中IL-23與WBC、EOS、血清IL-17、IL-17 mRNA、IL-17蛋白表達、Th17/CD4+T的相關分析Tab．3 Correlations between expression of IL-23 and total leukocyte numbers or eosinophil counts or IL-17 or IL-17mRNA or IL-17AOD or Th17/CD4+T in asthma group

3　討論

現代醫學理論認為，哮喘的本質是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種細胞及成分組成參與的氣道慢性炎癥。Th1/Th2失衡被認為是嗜酸細胞性哮喘主要的發病機制，而最近的研究表明，一種獨立于Th1、Th2細胞的輔助性T淋巴細胞Th17細胞，它在哮喘中起了重要作用。Th17細胞亞群作為新發現的CD4+T細胞的一個分支［9］，分化成熟的Th17細胞可以分泌IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22等多種細胞因子，其中IL-17是Th17分泌的最主要的效應細胞因子，Th17細胞主要是通過IL-17來發揮作用，Th17細胞可以募集、介導嗜酸性細胞和中性粒細胞的局部浸潤和組織損傷［10］，而且實驗證明，Th17淋巴細胞及相關細胞因子能加重哮喘小鼠氣道炎癥引發哮喘［11］。IL-23主要由樹突狀細胞、巨噬細胞分泌，盡管IL-23具有多種生物學作用，但其最重要的功能在于促進Th17細胞產生IL-17［3，9］。McGeachy通過研究IL-23R基因缺陷的小鼠發現，IL-23R缺陷的情況下，Th17細胞早期的活化受到抑制，Th17不能下調IL-2以及不能誘導IL-17的產生［12］。Li等［13］通過pSRZsi-IL-23p19沉默IL-23基因的研究顯示，可抑制肺組織IL-23/IL-17的表達及減少血清IL-23/IL-17的含量。最近F.D.Finkelman等［14］的研究發現，C5a通過限制樹突狀細胞分泌的IL-23來實現對IL-17A的調控，抑制氣道高反應性。以上表明IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸系在哮喘發生發展中起了重要作用。

雷公藤甲素(Triptolide TL，又叫雷公藤內酯醇)是從雷公藤中分離出來的二萜類化合物，具有抗炎和免疫調節作用。雷公藤甲素應用于臨床治療哮喘等疾病已有很多年歷史，對哮喘的預防及控制顯示出較好的作用，但其作用機制尚未十分清楚。Y.Wang及王敏等［5，6］體外細胞研究發現，雷公甲素可抑制Th17細胞的分化。最近Ying［15］研究表明，雷公藤甲素的免疫抑制功能主要是通過抑制Th17/ IL-17軸來實現，雷公藤甲素分離菌(Subglutinans)可有效阻止T細胞增殖和存活而深刻抑制分化完全的效應Th17細胞產生促炎性因子IL-17［16］。Th17在哮喘的發生、發展中起了重要作用，然而關于雷公藤制劑也是否能抑制哮喘患者或哮喘模型體內Th17細胞的分化以及其效應細胞因子IL-17，此類的研究目前尚未見報道。本研究發現，哮喘組BALF中炎癥細胞浸潤(白細胞、嗜酸性粒細胞)、BALF中IL-23、IL-17、肺組織IL-17 mRNA、IL-17蛋白表達、外周血Th17細胞的比例均較對照組增高，差異有顯著性，而且呈正相關; IL-23與th17(IL-17)呈正相關，這結果跟此前的研究是一致的［2，13］。IL-23與BALF中的白細胞及嗜酸性粒細胞亦呈正相關，提示IL-23能促進嗜酸性粒細胞在氣道的募集?？梢奍L-23/IL-17軸系在哮喘炎癥的發生發展中起重要作用，與文獻報道相一致［13，14］。在雷公甲素治療組和地塞米松治療組中，肺泡灌洗液中炎癥細胞浸潤(白細胞、嗜酸性粒細胞)較哮喘組明顯減少，其BALF中IL-23、IL-17含量、肺組織IL-17 mRNA、IL-17蛋白表達、外周血Th17細胞的比例較哮喘組降低，且差異有顯著性，提示雷公藤甲素通過下調IL-23表達抑制Th17細胞分化，進而減少IL-17的分泌，減輕哮喘氣道炎癥。IL-23/Th17(IL-17)炎癥軸可能是雷公藤治療哮喘的重要機制之一。

綜上所述，本研究表明雷公藤甲素能減輕哮喘小鼠氣道炎癥，其作用機制可能是通過抑制IL-23/ Th17(IL-17)炎癥軸實現，這可能是雷公藤甲素免疫抑制和抗炎作用的機制之一。相信通過本組實驗的研究，將會為哮喘的防治提供一個新的嘗試。

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［收稿2015-02-11修回2015-04-22］

(編輯張曉舟)

·生物治療·

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．011

通訊作者及指導教師:成俊芬(1963年－)，女，主任醫師，教授，碩士生導師，主要從事呼吸疾病的基礎和臨床研究，E-mail: 137290639 39@ 139.com。

作者簡介:楊志明(1981年－)，男，醫師，主要從事哮喘基礎與臨床研究，E-mail: 108179658@ qq.com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1347-06

文獻標志碼A

中圖分類號R52.2+5