模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步篩選與鑒定①

王湘豫　黃釗霞　侯曉睿　朱　平　富　寧　劉北一(南方醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，廣州510515)

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模擬金黃色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步篩選與鑒定①

王湘豫黃釗霞侯曉睿朱平富寧劉北一
(南方醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，廣州510515)

［摘要］目的:利用噬菌體展示肽庫技術篩選并鑒定可模擬金黃色葡萄球菌細胞壁脂磷壁酸(LTA)的表位。方法:以抗LTA單抗為靶分子，采用液相法對噬菌體12線性肽庫進行3輪淘選，夾心ELISA鑒定噬菌體克隆。對陽性噬菌體克隆進行DNA測序并推導氨基酸序列，選擇優勢序列合成線性肽，ELISA鑒定線性肽與抗體結合特異性。結果:經過三輪液相篩選，得到4個與抗LTA單抗特異性結合的陽性噬菌體克隆，序列分析顯示陽性克隆展示4種不同序列。選擇與單抗結合最好的序列GHxDFRQxxQPS合成線性短肽L2，ELISA結果顯示L2能夠與抗LTA單抗特異性結合。結論:利用噬菌體展示肽庫篩選技術獲得可模擬LTA表位的序列。

［關鍵詞］金黃色葡萄球菌;噬菌體展示肽庫; LTA;模擬肽

①本文受國家自然科學基金(31270980)和廣東省自然科學基金(S2012010009562)資助。

Screening and identification of peptide mimics to lipoteichoic acid by phage displayed random peptide library

WANG Xiang-Yu，HUANG Zhao-Xia，HOU Xiao-Rui，ZHU Ping，Fu Ning，LIU Bei-Yi.Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

［Abstract］Objective: To screen epitope mimics to lipoteichoic acid from a random 12-mer phage display peptide library and identify the specificity of the mimotopes of LTA.Methods: The monoclonal antibody against LTA was used as a target to screen the 12-mer phage display peptide library and the specificity of phage clones were identified by sandwich ELISA.The amino acid sequences of positive phage clones were deduced from DNA sequencing.The specificity of synthetic peptide were identified by sandwich ELISA.Results: 4 clones were obtained after 3 rounds of screening.Amino acid sequence analysis revealed four different types of mimotope sequence.A linear peptide (GHxDFRQxxQPS)，named L2，which derived from positive sequence was synthesized.ELISA result indicates that L2 can bind to anti-LTA mAb specifically in a dose-dependent manner.Conclusion: The mimotopes of LTA were obtained by using the phage display technology.

［Key words］Staphylococcus aureus; Phage display peptide library; Lipoteichoic acid; Mimic peptide

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一種寄居于人體皮膚和黏膜的革蘭氏陽性(G+)菌，是社區和院內感染的主要病原體之一［1］，除引發皮膚和軟組織感染［2］，還可引發威脅生命的肺炎、骨髓炎、腦膜炎、心內膜炎和膿毒血癥等［3］。近年來由于抗生素濫用導致細菌耐藥程度日趨嚴重，尤其是耐甲氧西林和耐萬古霉素的超級菌株的出現，給臨床治療帶來極大困難。2013年中國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示金黃色葡萄球菌中甲氧西林耐藥株的平均檢出率高達45.2%［4］。面對上述嚴峻形勢，針對金葡菌的疫苗和免疫學治療研究受到關注。然而目前尚無有效疫苗可預防金葡菌感染［5-7］，主要原因之一是金葡菌致病因子眾多，不同致病因子在感染不同階段表達并發揮不同作用［8］。因此尋找穩定表達于細菌表面的分子，以此作為構建聯合疫苗的靶點成為現階段研究方向［9］。

脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid)是金葡菌上一保守性結構。由磷酸二酯鍵連接的磷酸甘油殘基與1個膜載體共價連接的線性聚合物［10］。LTA是G+菌保守結構，無種屬特異性，LTA不僅表達于金葡菌表面，還廣泛存在于鏈球菌、糞球菌等革蘭氏陽性菌細胞壁表面。LTA除維持細菌細胞壁完整結構外［11，12］，還是細菌表面重要黏附分子，參與細菌對宿主細胞的黏附作用［7］，誘發中性粒細胞及巨噬細胞產生活性氧、NO、酸性水解酶和防御素等［13］。研究表明LTA在固有免疫應答中發揮起著重要作用［14-16］。他們可被TLR2識別，并能與CD14分子結合，從而活化單核細胞釋放大量促炎癥介質，介導感染性休克和多器官功能衰竭［17］，然而LTA為非胸腺依賴性抗原(TI抗原)，免疫原性弱，難以引起有效的再次抗體應答和細胞免疫應答。在本研究中以液相法篩選噬菌體肽庫，獲得模擬LTA表位陽性序列，為后續構建針對金葡菌保守結構LTA的肽類疫苗候選提供實驗數據。

1　材料與方法

1.1材料噬菌體隨機12肽庫(Ph.D.-12TMPhage display peptide library kit)，1×1013pfu/ml，購自New England Biolabs公司，受體菌為大腸桿菌E coli ER2738。蛋白G珠(protein G beads)購自Santa Cruz，辣根過氧化物酶標記的抗M13抗體(HRP-抗M13抗體)購自GE Heathcare公司，金黃色葡萄球菌脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid )購自Sigma公司，抗LTA單抗購自pierce公司，HRP-鏈酶親和素Streptavidin購自Jackson ImmunoResearch，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)購自北京鼎國生物技術有限公司和廣州斯佳生物技術有限公司，吐溫-20(Tween-20)、聚乙二醇8000(PEG-8000)購自南方醫科大學試劑中心。

1.2方法

1.2.1噬菌體肽庫篩選采用液相篩選法。具體操作步驟如下:蛋白G珠與TBS(含0.1%Tween)輕柔懸勻，低速離心后去上清，以5 mg/ml BSA于4℃封閉60 min。5 μl噬菌體線性12肽庫、50 μl 100 μg/ml抗LTA單抗及145 μl 0.1%TBST混勻室溫孵育20 min。蛋白G珠封閉后，以0.1%TBST洗滌4次，將噬菌體與抗體混合物轉入已洗滌的蛋白G珠中，輕柔混勻，室溫繼續孵育15 min。0.1%TBST洗滌10次，去上清加入含1 mg/ml BSA的0.2 mol/ L Gly-HCl(pH2.2)洗脫液，室溫孵育10 min后低速離心，留取上清立即加入150 μl 1 mol/L Tris-HCl (pH9.1)進行中和。將第一輪洗脫產物侵染ER2738、測滴度、擴增純化后，用于下一輪篩選。第2、3輪篩選除將洗液改為0.5%TBST以外，其余步驟同第一輪篩選。完成3輪篩選后，測定噬菌體滴度并隨機挑取藍色噬斑制備噬菌體原種用于鑒定。

1.2.2噬菌體克隆鑒定以pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗LTA單抗至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃過夜包被酶標板，0.25%酪蛋白37℃封閉2 h，0.5%PBST洗板3次后加入50 μl噬菌體原種上清或10倍系列稀釋陽性噬菌體克隆No.2，37℃孵育40 min。0.5%PBST洗板10次，加入HRP-抗M13單抗(應用時1∶3 000稀釋)，37℃孵育40 min，TMB室溫避光顯色，2 mol/L硫酸終止。以OD450nm值高于陰性對照3倍以上作為陽性噬菌體克隆。

1.2.3 DNA測序及序列分析擴增陽性噬菌體克隆，按常規方法提取噬菌體單鏈DNA。樣品送上海英濰捷基公司測序。

1.2.4選擇優勢序列合成模擬LTA抗原表位的線性短肽選擇與抗LTA單抗結合良好的No.2號所展示序列GHxDFRQxxQPS，委托深圳瀚宇有限公司合成線性肽L2(Biontin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS )，HS、GGGS為兩端起延長和支架作用的氨基酸殘基。

1.2.5 ELISA鑒定LTA模擬短肽與抗LTA單抗結合特異性抗LTA單抗以碳緩(pH9.6)稀釋，5 μg/ ml包被酶標條，4℃過夜。0.25%酪蛋白37℃封閉2 h后，依次加入系列稀釋，生物素標記的線性肽L2(以1 mg/ml起始)，37℃孵育1 h后，加入HRP-鏈酶親和素Streptavidin(1∶1 000稀釋)，37℃孵育40 min，TMB室溫避光顯色，2 mol/L硫酸終止，測OD450nm。每個反應間均以0.05%PBST洗滌3次。

2　結果

2.1三輪液相篩選回收率以抗LTA單克隆抗體為靶標，采用液相篩選法篩選噬菌體12肽庫。經3輪篩選，噬菌體富集率達300倍，富集效果明顯(表1)。所得噬菌體克隆可用于鑒定。

2.2噬菌體克隆與抗LTA單抗特異性結合隨機挑選45個噬菌體克隆進行鑒定，得到8個噬菌體克隆與抗LTA單抗結合(圖1A)。選擇其中與單抗結合最好的No.2號噬菌體克隆純化，10倍系列稀釋，ELISA鑒定其與抗LTA單抗結合，該克隆與抗體呈劑量依賴方式結合(圖1B)。上述結果提示液相篩選可以獲得模擬LTA表位的噬菌體克隆。

2.3陽性噬菌體克隆DNA測序及氨基酸序列推導

選擇與抗LTA單抗結合良好的4個陽性噬菌體克隆送出測序，根據DNA序列推導出4條完全不同的氨基酸序列(表2)。

表1　液相法篩選噬菌體肽庫回收率Tab．1 Measurement of recovery ratio after each round of solution-phase painning

Note: A.Positive phage clones bind to anti-LTA McAb specifically; B.Phage clone No.2 binds to anti-LTA McAb with a dose-dependent manner.

2.4線性肽L2與抗LTA單抗特異性結合基于No.2噬菌體克隆與抗LTA單抗結合，我們合成兩條線性肽L2 (Biotin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS)和L2-1(GHxDFRQxxQPSGGGS-己二胺-Biotin)。L2和L2-1核心序列(GHxDFRQxxQPS)均來自于No.2噬菌體克隆，為便于檢測，分別將生物素標記在L2肽N端和L2-1肽C端，其中在L2-1肽和生物素之間加入己二胺(便于在合成肽C端交聯生物素)。結果顯示，L2與抗LTA單抗呈劑量依賴方式結合(圖2A)，而在相同濃度下，L2-1不與抗LTA單抗結合(圖2B)。上述結果提示L2模擬LTA表位。

表2　液相法篩選所得陽性噬菌體克隆氨基酸序列Tab．2 Amino acid sequences of positive phage clones screened by solution-phase biopanning

圖2　線性肽L2與抗LTA單抗特異性結合Fig．2 Linear peptide L2 binds to anti-LTA McAb specifically

3　討論

目前金葡菌疫苗研究難題之一在于該病原體致病因子眾多，不同臨床分離株所表達致病因子不同，而且不同致病因子在感染不同階段表達。因此有必要選擇多個穩定表達于細菌表面的分子構建多價疫苗。支持這一理論的是近期Bagnoli F.等構建五價疫苗免疫后可誘導體液免疫應答，并在不同感染模型中具有保護作用［9］。

我們選擇金葡菌中保守性結構PGN和LTA作為疫苗研究候選，然而這兩個分子均屬于TI抗原，因其免疫原性弱而并不能成為疫苗。模擬肽可以作為糖脂類抗原替代物，免疫動物后可誘導記憶性免疫應答［18］，模擬肽疫苗候選已用于多種病原體實驗性疫苗研究［19，20］。我們在前期工作中通過肽庫篩選獲得多條模擬PGN表位序列，根據其中一條序列合成四分支多價抗原肽MAP-P31，以此抗原肽作為免疫原免疫小鼠后，可保護小鼠抵御金葡菌感染［21］。在此基礎上，本研究以抗LTA單抗為靶標篩選噬菌體肽庫以期獲得模擬LTA表位。為后續構建PGN模擬肽與LTA模擬肽雙價疫苗提供實驗依據。

噬菌體肽庫篩選包括固相法和液相法，前者以靶標蛋白直接包被后進行肽庫篩選，方法簡單;后者基于蛋白A/G株可結合靶標分子IgG，則采用先將IgG與肽庫在液相中孵育，再通過與蛋白A/G結合后淘洗、去掉未結合噬菌體克隆。液相篩選法與固相篩選法相比優勢在于避免得到非特異性吸附酶標板的克隆。我們曾嘗試以固相法篩選噬菌體肽庫，但回收率低，所得克隆中含非特異吸板克隆(數據未顯示)。因此在本研究中我們采用液相篩選法，表1顯示經三輪液相篩選，回收率逐輪提高;而且ELISA結果顯示我們所獲得陽性噬菌體克隆與LTA單抗結合，而不與酶標板反應(圖1A)。上述結果說明液相篩選可行性。我們所關注的No.2克隆所展示序列GHxDFRQxxQPS與固相篩選所得陽性克隆僅相差一個氨基酸，根據其序列所合成L2肽與抗LTA抗體特異結合，提示該序列模擬LTA表位。這為后續構建雙價合成肽疫苗提供實驗數據。

參考文獻:

［1］Lowy FD.Staphylococcus aureus infections［J］．N EngI J Med，1998，339(8) : 520-532.

［2］McCaig LF，McDonald LC，Mandal S，et al．Staphylococcus aureusassociate skin and soft tissue infections in ambulatory care［J］．Emerg Infect Dis，2006，12(11) : 1715-1723.

［3］Moran GJ，Krishnadasan A，Gorwitz RJ，et al．Methicillin-resistant S.aureus infections among patients in the emergency department ［J］．N EngI J Med，2006，355(7) : 666-674.

［4］胡付品，朱德妹，汪復，等.2013年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］．中國感染與化療雜志，2014，8(5) : 365-374 .

［5］Proctor RA.Is there a future for a Staphylococcus aureus vaccine? ［J］．Vaccine，2012，30(19) : 2921-2927.

［6］Lee JW，O’Brien CN，Guidry AJ，et al．Effect of a trivalent vaccine against Staphylococcus aureus mastitis lymphocyte subpopulations，antibody production，and neutrophil phagocytosis［J］．Can J Vet Res，2005，69(1) : 11-18.

［7］Adhikari RP，Karauzum H，Sarwar J，et al．Novel structurally designed vaccine for S.aureus α-hemolysin: protection against bacteremia and pneumonia［J］．PLoS One，2012，7(6) : e38567.

［8］Botelho-Nevers E，Verhoeven P，Paul S，et al．Staphylococcal vaccine development: review of past failures and plea for a future evaluation of vaccine efficacy not only on staphylococcal infections but also on mucosal carriage［J］．Exp Rev Vaccines，2013，12 (11) : 1249-1259.

［9］Bagnoli F，Fontana MR，Soldaini E，et al．Vaccine composition formulated with a novel TLR7-dependent adjuvant induces high and broad protection against Staphylococcus aureus［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2015，112(12) : 3680-3685.

［10］葛創，蔡元坤.脂磷壁酸相關最新研究進展［J］．上海醫學，2012，35(7) : 643-646.

［11］Weidenmaier C，Peschel A.Teichoic acids and related cell-wall glycopolymers in Gram-positive physiology and host interactions ［J］．Nat Rev Microbiol，2008，6(4) : 276-287.

［12］Gründling A，Schneewind O.Synthesis of glycerol phosphate lipoteichoic acid in Staphylococcus aureus［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(20) : 8478-8483.

［13］Ginsburg I.Role of lipoteichoic acid in infection and inflammation ［J］．Lancet Infect Dis，2002，2(3) : 171-179.

［14］Schr?der N W J，Morath S，Alexander C，et al．Lipoteichoic acid (LTA) of Streptococcus pneumoniaeand Staphylococcus aureus activates immune cells via Toll-like receptor (TLR) -2，lipopolysaccharide-binding protein (LBP)，and CD14，whereas TLR-4 and MD-2 are not involved［J］．J Biol Chem，2003，278(18) : 15587-15594.

［15］Seo HS，Michalek SM，Nahm MH.Lipoteichoic acid is important in innate immune responses to gram-positive bacteria［J］．Infect Immun，2008，76(1) : 206-213.

［16］Hermann C，Spreitzer I，Schr?der NW，et al．Cytokine induction by purified lipoteichoic acids from various bacterial species-Role of LBP，sCD14，CD14 and failure to induce IL-12 and subsequent IFNγ release［J］．Eur J Immunol，2002，32(2) : 541-551.

［17］Kengatharan KM，De Kimpe S，Robson C，et al．Mechanisms of Gram-positive shock: identification of peptidoglycan and lipoteichoic acid moieties essential in the induction of nitric oxide synthase，shock，and multiple organ failure［J］．J Exp Med，1998，188(2) : 305-315.

［18］Wierzbicki A，Gil M，Ciesielski M，et al．Immunization with a mimotope of GD2 ganglioside induces CD8+T cells that recognize cell adhesion molecules on tumor cells［J］．J Immunol，2008，181 (9) : 6644-6653.

［19］Ishikawa D，Kikkawa H，Ogino K，et al．GD1α-replica peptides functionally mimic GD1α，an adhesion molecule of metastatic tumor cells，and suppress the tumor metastasis［J］．FEBS Lett，1998，441(1) : 20-24.

［20］Fukuda MN，Ohyama C，Lowitz K，et al．A peptide mimic of E-selectin ligand inhibits sialyl Lewis X-dependent lung colonization of tumor cells［J］．Cancer Res，2000，60(2) : 450-456.

［21］Chen Y，Liu B，Yang D，et al．Peptide mimics of peptidoglycan are vaccine candidates and protect mice from infection with Staphylococcus aureus［J］．J Med Microbiol，2011，60(7) : 995-1002.

［收稿2015-05-26修回2015-07-10］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．015

通訊作者及指導教師:劉北一(1969年－)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事抗感染免疫和疫苗研究，E-mail: lbydodo@ 163．com。

作者簡介:王湘豫(1989年－)，女，主要從事抗感染免疫研究，E-mail: wxyjj_47@ 163．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1366-04

文獻標志碼A

中圖分類號R392.9