抑制URG4表達對宮頸癌小鼠的治療作用及機制

周　曦　陳忠東　何　璐　(南華大學附一醫院婦產科，衡陽421001)

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抑制URG4表達對宮頸癌小鼠的治療作用及機制

周曦陳忠東何璐(南華大學附一醫院婦產科，衡陽421001)

［摘要］目的:分析上調基因-4(URG4)在宮頸癌中的表達，并觀察分析抑制URG4對宮頸癌的治療作用及機制。方法: Western blot法分析URG4在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達差異。選擇16只雄性BALB/c裸鼠，喂養至6周齡后隨機分為對照組(Control組)及觀察組(Observation組)，每組各8只。Control組小鼠于右側背部皮下接種宮頸癌細胞(SiHa cells)。Observation組小鼠背部皮下接種URG4-siRNA轉染的宮頸癌細胞(URG4-siRNA SiHa cells)。干預后4周處死小鼠，分析對比小鼠腫瘤生長情況及Wnt/β-catenin信號通路的改變。結果: URG4在人宮頸癌組織中呈現高表達，顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。干預結束后，觀察組小鼠腫瘤組織內URG4表達量顯著低于對照組(P＜0.05) ;體重明顯高于對照組(P＜0.05) ;腫瘤組織重量顯著低于對照組(P＜0.05)。觀察組小鼠腫瘤組織內Ki67表達量顯著低于對照組(P＜0.05)。觀察組小鼠腫瘤組織內CyclinD1、β-catenin及C-myc的表達均顯著低于對照組，相比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。結論: URG4在人宮頸癌中呈現高表達，抑制URG4的表達可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而發揮抗腫瘤效應。

［關鍵詞］宮頸癌;上調基因-4; Wnt/β-catenin信號通路

Analyze curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and possible mechanisms

ZHOU Xi，CHEN Zhong-Dong，HE Lu.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，China

［Abstract］Objective: To analyze the curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and the possible mechanisms.Methods: The expression of URG4 were analyzed in cervical cancer tissues and para-carcinoma tissues.16 male BALB/c nude mice were divided into Group A (inoculated with URG4-siRNA SiHa cells) and Group B (inoculated with SiHa cells)．After 4 weeks，mice were executed and analyzed.Results: The expression of URG4 were higher in human cervical cancer tissues than that in para-carcinoma tissues (P＜0.05) .After experiment，Group A had a lower tumor weight，but a higher body weight than these of Group B，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of URG4 in tumor than that of Group B mice (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of Ki67 in tumor than that of Group B mice，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had lower levels of CyclinD1，β-catenin and C-myc in tumor than these of Group B mice (P＜0.05)．Conclusion: The expression of URG4 in cervical cancer tissue is up-regulation.Suppression expression of URG4 can suppress tumor growth in vivo，which may though suppress the Wnt/β-catenin signaling pathway.

［Key words］Cervical cancer; Upregulated gene 4; Wnt/β-catenin signaling pathway

宮頸癌(Cervical cancer)是臨床常見的婦科腫瘤，其發病率呈現升高趨勢，且具有年輕化傾向［1］。宮頸癌主要的病理類型為宮頸鱗癌，呈現為浸潤性生長。患者早期缺乏特異性的臨床表現，可僅表現為陰道接觸性出血或陰道排出血性、膿性分泌物。雖然以手術為主的綜合治療大大降低了該病的死亡率，但仍然有相當患者由于延誤診斷或治療而預后不良。迄今為止宮頸癌的發病機制尚不清楚，目前認為與遺傳、環境污染、病毒感染及不健康的性生活有關［2］。上調基因-4(Upregulated gene 4，URG4)位于人染色體7p13，是新近發現的促癌相關基因。URG4被證實在胃癌、神經母細胞瘤及淋巴細胞白血病等惡性腫瘤中表達升高，且與預后密切相關［3-5］。目前URG4與宮頸癌的關系尚無充分研究。本文嘗試分析URG4在人宮頸癌組織中的表達，并建立宮頸癌動物模型，觀察抑制URG4表達對宮頸癌是否有治療作用。

1　材料與方法

1.1臨床標本收集及檢測收集2014年1月至2015年1月我院收治的10例宮頸癌患者的手術標本。共納入10例患者，均經手術病理確診為宮頸鱗癌，平均年齡(49±3.9)歲。采集標本包括癌組織及癌旁組織(正常宮頸組織)，分別凍存(－80℃)。采用Western blot法分別檢測宮頸癌組織(Cervical cancer)及癌旁組織(Para-carcinoma)內URG4的表達。

1.2建立宮頸癌動物模型及干預選擇16只4周齡雄性BALB/c背景的裸鼠，均飼養在無特定病原菌級(Specific pathogen Free，SPF)環境中。保持飼養環境中每日12 h光照，維持室溫在20℃～24℃;避免強噪音及光線刺激;小鼠自由飲水，普通飼料喂養。待小鼠喂養至6周齡后隨機分為對照組(Control組)及觀察組(Observation組)，每組各8只。

兩組小鼠分別接受如下4周干預: Control組小鼠于右側背部皮下接種宮頸癌細胞(SiHa cells; 1× 107，0.2 ml; Ambion公司，USA) ; Observation組小鼠背部皮下接種URG4-siRNA轉染的宮頸癌細胞(URG4-siRNA SiHa cells; 1×107，0.2 ml)。URG4-siRNA SiHa cells由Ambion公司(USA)提供，URG4-siRNA轉染SiHa cells采用慢病毒載體，轉染效率75%，URG4-siRNA序列為: Sense: 5'-gatccgtagaccactcacatgtcctttcaagagaaggacatgtgagtggtctattttttggaaa-3'，Anti-sense: 5'-agcttttccaaaaaata-gaccactcacatgtccttctcttgaaaggacatgtgagtggtctacg-3'。細胞培養5代后開始用于實驗。

1.3觀察指標及檢測干預周期內，每周稱量小鼠體重并記錄; 4周后處死小鼠，剝離背部腫瘤組織保存(福爾馬林固定、－80℃凍存)，行如下檢測:采用Western blot法及免疫組化法檢測腫瘤組織內URG4及細胞增殖抗原標記物(Ki67)的表達;采用Western blot法檢測腫瘤組織內細胞周期蛋白(CyclinD1)、β-鏈蛋白(β-catenin)及原癌基因(C-myc)的表達。所有抗體均訂購于Abcam公司(Britain)。

Western blot方法簡述為:研磨并提取組織蛋白，使用Bradford法行蛋白定量，然后在沸水中加熱10 min，吸取35 μg蛋白加入孔，后電泳、轉膜，封閉1小時后加入URG4、CyclinD1、C-myc、β-catenin、Ki67及β-actin(1∶800稀釋，鼠源性單抗，Abcam公司)一抗稀釋液，4℃下搖床12 h，加入二抗后洗膜，滴加ECL顯影液，行灰度值分析(Image J軟件; USA)。免疫組化方法簡述:常規石蠟切片(4微米)，60℃烤片約8 h，行抗原修復后滴加一抗(分別為URG4、Ki67; 1∶50稀釋，鼠源性單抗，Abcam公司)，室溫下孵育60 min后滴加二抗(羊抗兔IgG， Santa cruz，USA)，室溫孵育10 min后采用PBS沖洗3次，滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，封片。

1.4統計學方法數據分析基于SPSS19.0統計分析軟件。連續性變量以x ±s表示，比較采用t檢驗。計數資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05定義為有統計學差異。

2　結果

2.1 URG4在宮頸癌組織中的表達如圖1所示，Western blot半定量分析顯示URG4在人宮頸癌組織中呈現高表達，顯著高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2比較兩組小鼠腫瘤組織內URG4的表達差異

如圖2A所示，免疫組化染色證實:觀察組小鼠腫瘤組織內URG4表達量顯著低于對照組，相比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。Western blot分析進一步證實了這一結果(圖2B)。

2.3抑制URG4表達對宮頸癌小鼠體重及腫瘤生長的影響圖3A所示，實驗第3、4周，觀察組小鼠體重明顯高于對照組，相比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。如圖3B，觀察組小鼠腫瘤組織重量顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.4抑制URG4表達對宮頸癌小鼠腫瘤內Ki67表達的影響如圖4A所示，免疫組化分析顯示:觀察組小鼠腫瘤組織內Ki67表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。Western blot分析進一步證實了這一結果(圖4B)。

Note: * .P＜0.05.

2.5抑制URG4對小鼠腫瘤組織內Wnt/β-catenin信號通路的影響Western blot分析顯示(圖5)，觀察組小鼠腫瘤組織內CyclinD1、β-catenin及C-myc的表達均顯著低于對照組，相比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of URG4 (Brown) in the two groups; B.The comparison of URG4 expression between the two group mice.

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of Ki67 (Brown) in the two groups; B.The comparison of Ki67 expression between the two group mice.

圖3　兩組小鼠體重及腫瘤重量的比較Fig．3 Comparison of weight and tumor size between two groups

Note: The comparison of Cyclin D1，β-catenin，C-myc expression between two group，* .P＜0.05.

3　討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅患者生命健康。盡管近幾十年腫瘤學科有了長足的發展與進步，但仍然未能全面揭示其發病機制。目前認為其是遺傳易感個體在環境因素作用下發病。URG4的基因位于人體第7號染色體，能夠編碼超過900余種氨基酸。URG4具有多種生物學功能，其可以促進腫瘤細胞的增殖及轉移。目前發現URG4在多種惡性腫瘤組織中呈現高表達，包括子宮內膜癌、卵巢癌等［6-8］，說明其與生殖系統腫瘤的發展與發展密切相關。目前URG4在宮頸癌發生與發展過程中的作用尚不十分明確。本文嘗試首先分析宮頸癌腫瘤組織內URG4的表達是否有改變。在此基礎上進一步建立宮頸癌動物模型，分析抑制URG4是否可以抑制腫瘤生長，并分析可能的機制。

我們的研究發現，URG4在宮頸癌中呈現高表達，顯著高于癌旁組織，這提示URG4可能與腫瘤的發生與發展有關。為了明確URG4對宮頸癌的發展是否有關，我們建立了宮頸癌小鼠模型。我們采用免疫組化及Western blot兩種方法均證實接種URG4-siRNA轉染的宮頸癌細胞的小鼠(觀察組)，其腫瘤組織內URG4的表達顯著低于對照組。進一步分析發現觀察組小鼠腫瘤重量顯著低于對照組，但平均體重顯著高于對照組。這提示抑制URG4表達顯著抑制了腫瘤生長，并同時改善了小鼠全身狀況。我們進一步分析了兩組小鼠腫瘤組織內Ki67的表達，發現觀察組小鼠腫瘤組織內Ki67表達顯著低于對照組。Ki67是一種由MKI-67基因編碼的核蛋白質，主要表達于增生活躍的細胞中，是常用的細胞增殖標記物［9，10］。這提示抑制URG4表達，顯著抑制了腫瘤細胞增殖，發揮了抗腫瘤的作用。為了明確抑制URG4而達到抗腫瘤的機制，我們進一步分析了小鼠腫瘤組織內Wnt/β-catenin信號通路的改變。我們發現Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白(CyclinD1、β-catenin及C-myc)在觀察組小鼠腫瘤組織內表達均顯著低于對照組。CyclinD1是一種細胞周期調節因子，其表達具有嚴格的細胞周期順序性，主要表達于細胞周期的G1期與S期。CyclinD1的過度表達與多種人類原發惡性腫瘤相關，也是腫瘤診斷與預后判斷的重要指標［11］。C-myc與多種腫瘤的發生相關，是促使細胞無限增殖惡性化的主要調節基因［12］。β-catenin是Wnt/β-catenin信號傳導途徑中的關鍵調控因子，其在多種腫瘤組織呈現高表達，可以促進腫瘤細胞增殖［13，14］。此外，βcatenin還可上調C-myc及CyclinD1的表達［15］。我們的研究顯示抑制URG4的表達可以抑制Wnt/βcatenin信號通路，這可能是其發揮抗腫瘤作用的機制之一。

我們的研究顯示，URG4在人宮頸癌中呈現高表達，抑制URG4的表達可能通過抑制Wnt/βcatenin信號通路而發揮抗腫瘤效應。

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［收稿2015-06-20修回2015-07-07］

(編輯許四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．023

作者簡介:周曦(1973年－)，女，副主任醫師，副教授，主要從事婦科腫瘤方面研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1400-04

文獻標志碼A

中圖分類號R737