過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞與Treg細胞失衡的研究

張　玲　(湖北民族學院附屬民大醫院兒科，恩施445000)

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過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞與Treg細胞失衡的研究

張玲(湖北民族學院附屬民大醫院兒科，恩施445000)

［摘要］目的:探討Th17細胞和Treg細胞失衡在兒童過敏性紫癜(Anaphylactoidpurpura，AP)免疫發病機制中的作用。方法:采用流式細胞儀檢測52例AP患者外周血Th17細胞和Treg細胞的表達率，采用酶聯免疫吸附方法(ELISA)檢測外周血中細胞因子IL-6、TGF-β等的表達水平。同期30例性別、年齡匹配健康兒童作為對照。結果:過敏性紫癜急性期患兒外周血中Th17細胞比例明顯高于正常對照組(P＜0.05)，Th17細胞調控因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23水平表達亦明顯增高(P＜0.05)。Treg細胞及其調控因子IL-10和TGF-β1明顯低于對照組(P＜0.05)。結論:兒童過敏性紫癜患兒外周血Th17、Treg細胞及其關鍵調控因子IL-6、TGF-β等水平的比例失平衡可能與兒童過敏性紫癜的發病密切相關。

［關鍵詞］兒童;過敏性紫癜; Th17細胞; Treg細胞

Research on imbalances of peripheral blood Th17 cells and Treg cells in Anaphylactoid purpura children

ZHANG Ling.Pediatrics of Affiliated Hospital of Hubei National Institute，Enshi 445000，China

［Abstract］Objective: To evaluate the roles of imbalance between peripheral blood T helper17(Th17) cells and CD4+CD25+regulatory T(Treg) cells in the pathogenesis of Anaphylactoid purpura(AP) .Methods: Peripheral blood samples were obtained from fifty-two patients with AP and thirty age-and sex-matched healthy controls.The percentage of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood were detected with Flow cytometry．Furthermore，the serum level of IL-6，IL-17，IL-22 and IL-23 and transforming growth factor (TGF) -β and IL-10 were detected with the use of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) .Results: In comparison with the controls，the AP children showed a higher percentage of Th17 cells and an increased serum level of IL-6，IL-17，IL-22 and IL-23(P＜0.05)，but the percentage of Treg cells and the serum level of TGF-β and IL-10 were significantly lower in AP group(P＜0.05)．Conclusion: AP children experience a change in the percentage of peripheral blood T helper17 cells and CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood.The imbalance between the Th17 cells and Treg cells in peripheral blood may contribute to the development of Anaphylactoid purpura.

［Key words］Children; Anaphylactoid purpura; T helper17 cells; Regulatory T cells

過敏性紫癜(Anaphylactoid purpura，AP)是一種兒童時期多發的、主要波及小血管的自身免疫性血管炎性疾病，常見臨床表現包括紫癜、消化道癥狀、關節痛和腎損害。目前普遍認為AP患兒體內免疫功能失衡與其病理、臨床表現密切相關，在其發病中起著重要的作用［1，2］。

近年發現Th17和Treg細胞的穩態對維持正常免疫應答及防止自身免疫性疾病的發生相關，但該平衡的狀態與AP發生發展的關系尚不清楚［3-6］。本研究旨在分析AP患兒外周血內Th17細胞與Treg細胞的比率及相關細胞因子IL-6、TGF-β1等的變化，為進一步探討兒童過敏性紫癜的免疫學機制提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2013年12月在我院兒科就診的AP急性發作期患兒52例，其中，男30例，女22例;年齡2～14歲，平均(7.28± 4.0)歲;所有患兒均符合過敏性紫癜的診斷標準。所有患兒均為初次發病，既往均未使用任何糖皮質激素或細胞毒性藥物。正常對照組選擇我院健康體檢中心體檢正常兒童，包括男16例，女14例，年齡4～14歲，平均年齡(7.61±3.8)歲，所有對照組入選兒童均排除家族過敏史及自身免疫病史。兩組患兒在性別、年齡、骨折部位等差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究所有受試對象均知情同意并經院倫理委員會討論批準。

1.2標本采集及實驗方法所有受試者在入院后

24 h內空腹無菌采集外周靜脈血約6 ml，置于抗凝管中，分別分成兩管，每管約3 ml。其中一管運用密度梯度離心法分離單一核細胞(PBMC)，待流式細胞儀檢測;另一管離心后(3 500 r/min，5 min)留取血清，于－20℃存放備用待檢測。采用購自Becton Dickimn公司的FACS Calibur流式細胞儀檢測外周血Th17與Treg細胞［7］。取上述凍存血清，采用ELISA抗體夾心法檢測細胞因子IL-6、IL-17、IL-22、IL-23和IL-10、TGF-β1［8］。采用TRIzol法提取細胞總RNA，分別以RORγt mRNA、Foxp3 mRNA特異性引物在PCR擴增儀上進反轉錄酶-聚合酶鏈連鎖反應(RT-PCR)。后用瓊脂糖凝膠電泳成像系統掃描以檢測基因，并與內參照的條帶灰度值的比值讀取該基因mRNA的表達水平

1.3統計學方法應用SPSS17.0(SPSS Inc，Chicago，IL)軟件進行統計學分析，計量資料統計值以x ±s表示。兩組獨立樣本比較，對正態分布計量資料采用t檢驗，Wilcoxon秩和檢驗用于非正態分布計量資料的比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　兒童過敏性紫癜組與對照組Th17、Treg表達率比較(x±s，%)Tab．1 Comparison of expression rate of Th17/Treg cellbetween AP group and control group(x±s，%)

表2　兒童過敏性紫癜組與對照組轉錄因子表達率比較(x ±s)Tab．2 Comparison of expression of transcription factors between AP group and control group(x ±s)

表3　兒童過敏性紫癜組與對照組Th17細胞及相關細胞因子比較(x ±s，ng/L)Tab．3 Comparison of serum level of Th17-related cytokines between AP group and control group(x ±s，ng/L)

2　結果

2.1兒童過敏性紫癜組與對照組Th17、Treg表達率比較本研究通過對52例AP患兒和30例正常對照者進行檢測，發現AP組外周血中Th17細胞比例為(1.20±0.41) %，高于對照組(0.54±0.28) %，差異具有統計學意義(P＜0.05) ;同時，急性期AP患兒外周血Treg細胞比例為(2.29±0.67) %，低于對照組(5.95±0.45) %，差異具有統計學意義(P＜0.01，表1)。

2.2兒童過敏性紫癜組與對照組轉錄因子表達率比較RORγt和Foxp3分別是Th17和Treg細胞的轉錄因子。如表2所示，急性期AP患兒RORγt的表達明顯高于正常對照組(P＜0.0001)，而Foxp3的表達率明顯低于對照組(P＜0.0001)。

2.3兒童過敏性紫癜組與對照組Th17細胞/Treg細胞相關細胞因子比較IL-6、IL-17、IL-22和IL-23 是Th17細胞的相關細胞因子，急性期AP患兒以上細胞因子的表達均高于正常對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05) (表3)，而AP急性期患兒Treg細胞細胞因子IL-10和TGF-β1表達明顯低于對照組(P＜0.05) (表4)。

表4　兒童過敏性紫癜組與對照組Treg細胞相關細胞因子比較(x ±s，ng/L)Tab．4 Comparison of serum level of Treg cell-related cytokines between AP group and control group (x ±s，ng/L)

3　討論

過敏性紫癜(AP)是兒童期常見的自身免疫性血管炎性疾病，感染是目前已知誘發AP發病的重要原因，但具體免疫發病機制尚未闡明。近年研究顯示AP急性期患兒體內存在體液免疫紊亂、T細胞亞群功能失調及細胞因子分泌異常等多種免疫功能失衡，且與其病理、臨床表現密切相關［1，2，6，8-10］。

Th17和Treg是CD4+T細胞的兩種功能不同的細胞亞型［3，5］。Th17細胞分泌的IL-17等炎癥細胞因子可誘導體內單核巨噬細胞等產生多種前炎癥細胞因子及趨化因子，介導機體炎癥反應和自身免疫性疾病的發生。既往發現哮喘、強直性脊柱炎、炎癥性腸病、類風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病患者體內的Th17細胞比例均有增加。Treg細胞是一類具有抑制自身免疫功能的T細胞亞群，正常情況下外周血中一定數量的Treg細胞能抑制Th17細胞的增生及其細胞因子的產生，起到免疫調節的作用。Th17細胞和Treg細胞的平衡是維持機體免疫穩態的重要因素［6］。目前Th17/Treg的平衡在許多免疫性疾病和感染性疾病發病機制中的作用得到廣泛的研究。

既往研究發現在過敏性紫癜患兒外周血中，急性期調節性CD4+CD25+T細胞亞群Treg細胞比例明顯降低，其轉錄因子的表達亦明顯降低。與此同時，CD4+T細胞IL-17A及IL-17F表達增高。Th17細胞轉錄因子ROR-γt等前炎癥細胞因子的mRNA表達亦明顯增高［7，8，11-14］。由此表明，調節性T細胞的減少并由此引起免疫抑制效應不足可能是過敏性紫癜急性期免疫失衡的重要原因。我們的研究顯示過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞的比率為(1.20± 0.41) %，AP患者組血清Th17的含量明顯高于對照組。同時，急性期AP患兒外周血中Treg細胞比例為(2.29±0.67) %，低于對照組(5.95±0.45) %，差異具有統計學意義。

轉化生長因子-β(TGF-β)和白細胞介素6(IL-6)是兩種誘導初始CD4+T細胞分化的關鍵細胞因子，TGF-β通過在外周誘導Foxp3蛋白的表達，從而維持Treg細胞的數量、功能［8，11］。但是，當體內存在有較高濃度的IL-6時，其可在抑制TGF-β誘導表達Foxp3同時，誘導轉錄因子ROR-γt的表達，使初始CD4+T細胞分化為Th17亞細胞群。通過對52 例AP患兒和30例正常對照者血清Th17和Treg細胞相關細胞因子的水平進行檢測發現，AP患兒組血清IL-6、IL-17、IL-22和IL-23的含量明顯高于對照組; AP患兒組血清IL-10和TGF-β1的含量明顯低于對照組(P＜0.01)。關鍵調控因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23在急性期AP患者外周血中高表達，IL-10和TGF-β1的表達降低說明過敏性紫癜急性期患兒Th17細胞過度活化及Treg細胞表達不足可能與感染因素誘導的IL-6高表達及Th17/Treg失平衡有關。

綜上所述，過敏性紫癜患兒外周血中Th17細胞及其調控因子IL-6水平增高，Treg細胞及其調控因子TGF-β降低，從細胞和細胞調控因子水平表明急性期過敏性紫癜患兒體內存在Th17/Treg失平衡，其具體機制及能否通過臨床調節IL-6等關鍵調控因子的表達更好地控制AP的免疫炎性反應，尚需進一步探討。

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［收稿2015-01-20修回2015-02-04］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．024

作者簡介:張玲(1965年－)，女，副主任醫師，主要從事行為發育、臨床醫療感染等方面研究，E-mail: zhangling _ hb @ 126.com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1404-03

文獻標志碼A

中圖分類號R725