種植窗期uNK對血管生成的影響及子宮動脈血流與胚胎種植的相關性研究

劉新貴　孫瑩璞　郭藝紅　(鄭州大學第一附屬醫院生殖中心，鄭州450052)

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種植窗期uNK對血管生成的影響及子宮動脈血流與胚胎種植的相關性研究

劉新貴孫瑩璞郭藝紅(鄭州大學第一附屬醫院生殖中心，鄭州450052)

［摘要］目的:探討體外受精-胚胎移植患者種植窗期子宮內膜自然殺傷細胞(uNK)對子宮內膜微血管的影響及子宮動脈搏動指數與胚胎種植的關系。方法:回顧性分析本院2009年1月至2013年7月實施體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的37例患者的臨床資料，根據是否妊娠成功及至少2次行IVF-ET失敗分為成功組(26例)和失敗組(11例)，比較兩組研究對象種植窗期的子宮內膜uNK細胞標記物CD56+、子宮動脈搏動指數、血管內皮標記物F8因子、ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑSMA)及重鏈肌球蛋白(SMM)的表達差異及其相互關系。結果:成功組的基礎FSH 3.52±0.68(mU/ml)、基礎竇卵泡9.44±2.53(個)與失敗組比較差異均不具有統計學意義(P＞0.05)。成功組的uNK細胞27.18±5.94(%)、MVD 6.79±1.74(%)、ɑSMA 33.72±4.19 (%)、SMM 25.19±5.83(%)表達率均顯著高于IVF-ET助孕失敗組(P＜0.05)。種植窗期37例患者的子宮內膜uNK細胞比例與MVD數目、ɑSMA及SMM著色細胞數比例均呈顯著的正相關性［(r = 0.472，P = 0.000＜0.005)、(r = 0.426，P = 0.000＜0.005)、(r=0.512，P=0.000＜0.05)］。成功組種植窗期的子宮動脈PI= 0.94±0.28，失敗組的PI= 0.87±0.29，兩組比較差異不具有統計學意義(t=0.688，P=0.493＞0.05)。結論:種植窗期的子宮內膜組織中自然殺傷細胞與子宮內膜血管生成具有顯著的相關性，可能與成功妊娠具有一定的關系;子宮動脈PI與妊娠結局是否成功關系不明顯。

［關鍵詞］體外受精-胚胎移植;種植窗期;子宮內膜;自然殺傷細胞;子宮動脈搏動指數;胚胎種植

Study on correlation of implantation window phase effect of uNK on angiogenesis and uterine artery blood flow and embryo implantation

LIU Xin-Gui，SUN Ying-Pu，GUO Yi-Hong.Reproductive Center of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

［Abstract］Objective: In vitro fertilization and embryo transplantation in patients with endometrial implantation window phase of natural killer cell (uNK ) influence on the endometrial microvascular and uterine artery pulsatility index and embryo implantation.Methods: A retrospective analysis of our hospital from January 2009 to July 2013 the implementation of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET) clinical data of 37 patients，according to whether the success of pregnancy and at least 2 times for IVF-ET failure into success group(26 cases) and the failure group(11 cases)，compared two groups of research object during the window of implantation in the uterus endometrial uNK cell marker CD56+，uterine artery pulsatility index，vascular endothelial marker F8 factor，alpha smooth muscle actin(alpha SMA) and myosin heavy chain(SMM) and the relationship between the expression of difference.Results: Success group based FSH 3.52±0.68(mU/ml)，basal antral follicles of 9.44±2.53 compared with the failure group differences were not statistically significant(P＞0.05) .The successful group of uNK cells of 27.18±5.94(%)，MVD 6.79±1.74 (%)，αSMA 33.72±4.19(%)，SMM 25.19±5.83(%) were significantly higher than the expression rate of IVF-ET assisted reproductive failure group(P＜0.05) .The number of uNK cells，the proportion of endometrium during the window of implantation and MVD of 37 patients with αSMA and SMM coloring cell number proportion were positive correlation significantly(r= 0.472，P= 0.000＜0.005)，(r= 0.426，P=0.000＜0.005)，(r=0.512，P=0.000＜0.05) .Success group during the window of implantation in the uterine artery PI= 0.94±0.28，PI=0.87±0.29 failure group，differences between the two groups was not statistically significant(t = 0.688，P= 0.493＞0.05) .Conclusion: During the window of implantation in the endometrium of natural killer cells and endometrial angiogenesis was significantly associated with successful pregnancy，may have a certain relationship; uterine artery PI and pregnancy outcome successful has no obviously relationshhip.

［Key words］In vitro fertilization and embryo transfer; Implantation window phase; Endometrium; Natural killer cell; Uterine artery pulsatility index; Embryo implantation

體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transer，IVF-ET)是目前已有幾十年臨床應用歷史的輔助生殖技術，其對不孕不育癥的治療取得了令人滿意的效果，但是還有部分患者接受多次IVF-ET治療仍未成功妊娠。據報道，大約有一半不孕患者IVF-ET治療失敗，且原因至今不清，可能與女性子宮腔內的微環境有關［1］。因此，目前越來越多的學者研究種植窗期女性子宮內的微環境變化對胚胎種植結局的作用及其影響因素。uNK細胞是子宮內獨有的細胞，其細胞表型為CD56+CD16－。有文獻報道，uNK細胞與患者種植窗期微血管的生成有一定的關系［2］。本文旨在研究種植窗期女性子宮內uNK細胞與患者微血管生成和血流間的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象以本院2009年1月至2013年7月實施體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的37例患者作為研究對象，根據是否妊娠成功及至少2次行IVFET失敗分為成功組(26例)和失敗組(11例)。成功組:年齡27～35歲，平均年齡(33.68±2.52)歲;不孕年限1～8年，平均年限(4.8±2.9)年。失敗組:年齡28～36歲，平均年齡(34.12±1.46)歲;不孕年限1～9年，平均年限(5.0±2.2)年。兩組患者的年齡、不孕年限差異均不具有統計學意義(P＞0.05)，均有可比性。

納入標準:因輸卵管堵塞、輸卵管粘連、重度子宮內膜異位癥等原因造成的不孕患者;經過輸卵管再通術、整形術等治療措施無效的患者;入選患者的基礎卵泡雌激素(FSH)≤10 mU/ml，每一個治療周期獲得至少8枚卵子，至少5枚可用于胚胎移植手術;所有患者均接受中長期黃體方案;均為自愿接受IVF-ET治療;治療實施前均簽訂知情同意書。

排除標準:輸卵管積水、卵巢反應不良及子宮內膜受損等嚴重影響胚胎移植成功的因素;合并免疫類風濕疾病(類風濕性關節炎、系統紅斑狼瘡等)疾病的患者;合并嚴重感染、生殖器解剖功能嚴重障礙、內分泌嚴重異常、染色體異常、甲狀腺疾病等因素引起的不孕患者。

1.2標本采集在患者月經周期的第10天使用尿黃體生成素(LH)試紙測量其尿液中LH的濃度，在LH峰值后的第7～9天采用陰道超聲檢查子宮動脈的搏動情況，刮取少量宮腔內膜組織，福爾法琳溶液浸泡，石蠟包埋制作切片。

1.3指標檢測方法切片去除石蠟后浸泡于水中，加入0.1 g/L的蛋白酶K，37℃下放置30 min;水洗后H2O2甲醇溶液浸泡半小時，雙蒸水沖洗，然后泡于PBS中5 min。加入兔抗人CD56+、F8因子、αSMA、SMM的相關抗原多抗隆抗體(均購自北京中山生物科技有限公司)，4℃過夜。然后用PBS沖洗3次，每次10 min。加入生物素標記的1∶100稀釋的二抗，37℃孵育半小時，PBS沖洗3次，每次10 min。3-氨基-9-乙基咔唑顯色試劑進行10 min的顯色，自來水沖洗后，重復染色，封片。1∶100稀釋的一抗為PBS的切片為陰性對照，CD56+、F8因子、αSMA、SMM的相關抗體為一抗的切片為陽性對照。

1.4結果評定標準子宮內膜微血管(MVD)計數:血管內皮細胞標志物F8因子相關抗原染色后，采用顯微鏡(BX51型)對組織切片進行觀察，DP-70進行圖像采集，在顯微鏡(×100倍)下找出MVD著色較為密集的區域，再于×400倍的顯微鏡下進行MVD計數，求取其平均值。

CD56+、ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑSMA)、重鏈肌球蛋白(SMM)染色全陰性，切片中所有細胞均為著色，保持與背景顏色一致的色彩。

CD56+、ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑSMA)、重鏈肌球蛋白(SMM)染色陽性，uNK細胞標記物CD56+位于包膜間質或細胞質，ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑSMA)、重鏈肌球蛋白(SMM)在血管內皮著色呈清楚的棕色，選取著色較為清楚的5個視野，對視野中CD56+、ɑSMA、SMM細胞進行計數，計算百分率，取均值。

子宮動脈血管搏動指數(PI)的測量，本研究采用美國GE公司生產的三維彩超儀進行測量，PI=(子宮動脈收縮期最大血流速度-舒張期最小血流速度) /平均血流速度。

1.5統計學分析統計分析在SPSS17.0中進行。計量資料以(x ±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;相關性分析采用Pearson分析法。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

表1　兩組研究對象的基礎FSH及竇卵泡數量情況(x ±s)Tab．1 Basis of FSH and antral follicle count in two groupsof subjects(x±s)

2.1兩組研究對象的基礎FSH及竇卵泡數量情況

成功組的基礎FSH(3.52±0.68) mU/ml、基礎竇卵泡(9.44±2.53)個與失敗組比較差異均不具有統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

2.2兩組研究對象的uNK細胞、MVD數目、ɑSMA及SMM著色細胞數比較成功組的uNK細胞27.18±5.94 (%)、MVD 6.79±1.74 (%)、ɑSMA 33.72±4.19(%)、SMM 25.19±5.83(%)表達率均顯著高于IVF-ET助孕失敗組(P＜0.05)，詳見表2。圖1A為uNK細胞在種植窗期子宮內膜的表達，圖1B為子宮內膜微血管計數(MVD%)，圖1C為ɑSMA在子宮內膜內皮血管上的表達情況，圖1D為SMM在子宮內膜內皮血管上的表達情況。

2.3 37例行IVF-ET患者的uNK細胞、MVD數目、ɑSMA及SMM著色細胞數比例相關性分析種植窗期37例患者的子宮內膜uNK細胞比例與MVD數目、ɑSMA及SMM著色細胞數比例均呈顯著的正相關性(r = 0.472，P = 0.000＜0.005)、(r = 0.426， P= 0.000＜0.005)、(r = 0.512，P = 0.000＜0.05)。見圖2。

2.4兩組研究對象的PI值差異成功組種植窗期的子宮動脈PI = 0.94±0.28，失敗組的PI = 0.87± 0.29，兩組比較差異不具有統計學意義(t = 0.688，P=0.493＞0.05)，見圖3。

表2　兩組研究對象的uNK細胞、MVD數目、αSMA及SMM著色細胞數比較(x ±s)Tab．2 Comparison of number of uNK cells，number of MVD，αSMA and SMM staining alpha of two groups (x±s)

圖1　 uNK細胞、MVD數目、αSMA及SMM著色Fig．1 Expression of uNK cells，MVD counting，αSMA and SMM staining

圖2　 uNK細胞與MVD、αSMA、SMM的相關性Fig．2 Correlation of uNK cells and MVD，uNK cells and αSMA，uNK cells and SMM

圖3　兩組研究對象的PI值差異Fig．3 Success group and failure group PI value

3　討論

體外受精-胚胎移植，又可稱之為試管嬰兒，是臨床上治療不孕癥的重要手段［3］。IVF-ET的過程主要為先采用藥物促進多個卵泡發育成熟，分泌多個卵子［4］;然后借助陰道超聲取出成熟的卵子;短時間內將卵子與已處理過的精子體外共同培養，形成受精卵，繼續培養一段時間待其發育為胚胎后即可將其植入到母體的子宮腔內。種植窗期是患者能否成功妊娠的關鍵時期，也是胚胎能否在子宮腔內存活的關鍵時期。女性子宮腔內的微環境是決定胚胎是否可以種植成功的關鍵。

有研究報道，uNK細胞在沒有妊娠女性的子宮內膜中其數量是隨著月經周期的變化而變化的，卵泡成熟分泌卵子前，uNK細胞數量較少，但在卵子排出黃體中期的時候其數量開始增加，一直到分泌晚期其值達到最大，而且該細胞十分貼近內膜的腺體和螺旋血管［5］。本文成功組的uNK細胞數目明顯高于助孕失敗組患者，并且其空間分布情況與上述報道一致，通常采用微血管密度(MVD)評估血管生成情況［6］，如果MVD的值越高說明新生的微血管越多。因此，檢測患者種植窗期子宮內膜的MVD值對判斷子宮內膜能否成功容受胚胎種植具有重要意義。本文成功組患者子宮內膜中的MVD數量明顯高于助孕失敗組患者，且MVD與uNK細胞的表達間存在正相關關系，說明uNK細胞數量越多，內膜中新生的微血管越多，uNK細胞對微血管的生成有一定的促進作用。

胚胎在子宮腔內種植及其生長發育均需要充分的血供和營養物質，可明顯增大子宮循環血液的需求量［7］，故該時期子宮內膜多發生血管重塑，主要是通過血管擴張和形成新的血管來應答該種需求［8］。但子宮內膜血管的數量、分布和功能受到嚴格的調控，伴隨著月經周期發生變化，該變化通常有規律可循。只有血管結構中含有血管平滑肌的微血管才可調節子宮內膜中螺旋小動脈的生成和血流量。αSMA、SMM可作為血管平滑肌的分化指標，用于評估血管的成熟度。本研究結果顯示，成功組患者ɑSMA和SMM的表達率均顯著高于IVF-ET助孕失敗組，且其與uNK細胞比例呈顯著的正相關性，與相關文獻報道一致［9］。

胚胎種植過程中的關鍵因素之一即是子宮內膜的血液供應，月經結束后遺留的螺旋動脈斷端可以芽生出新的微血管，保證子宮內膜的血液供應。如果母體子宮的血液供應發生病變，特別是過早的形成母體循環，可使胚胎種植部位的血運發生障礙，血液明顯增加，導致該部分發生過度氧化應激反應阻礙胚胎的種植和生長發育。目前，人們對于子宮動脈搏動指數對妊娠結局的影響仍有很大的爭議［10］。本文兩組患者在種植窗期間子宮動脈搏動指數無明顯差異，只是檢查比較兩組患者子宮動脈的搏動指數并不能全面準確地反應子宮內膜螺旋動脈及其分支、微血管的血運情況，無法準確評估患者的妊娠結局。

綜上所述，種植窗期的子宮內膜組織中uNK細胞與子宮內膜新生血管的生成間存在正相關關系，可能與胚胎的成功種植有一定的關系，但子宮動脈搏動指數對胚胎種植的影響需要進一步擴大樣本量深入研究。

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［收稿2015-01-28修回2015-02-06］

(編輯許四平)

·教學園地·

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．025

作者簡介:劉新貴(1969年－)，男，主管技師，主要從事生殖與基礎內分泌研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1407-04

文獻標志碼A

中圖分類號R714.8