增殖性糖尿病視網膜病變患者玻璃體液中PEDF與TAOC的關系研究

通信作者：路強，男，博士，主任醫師，碩士生導師，研究方向：眼底病病， E-mail：drluqiang@163.com。

增殖性糖尿病視網膜病變患者玻璃體液中PEDF與TAOC的關系研究

楊曉靜1， 路強2, 張海濤3

(1內蒙古自治區中醫醫院眼科, 呼和浩特010021；2內蒙古自治區人民醫院眼科， 呼和浩特010017；

3武警內蒙古總隊醫院檢驗科， 呼和浩特010021)

摘要：目的探討增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)患者玻璃體液中色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)與總抗氧化能力(total anti-oxidant capacity ，TAOC)的關系。方法選擇行玻璃體切割術的增殖性糖尿病視網膜病變患者20例(20眼)，其中PDR合并玻璃體出血組12眼，PDR無玻璃體出血組8眼。非糖尿病患者18例(18眼)作為對照組。采用ELISA方法測定玻璃體液中PEDF和TAOC的水平，并行統計學分析。結果與對照組比較，PDR患者玻璃體液中的TAOC明顯降低(P<0.01)。玻璃體液中PEDF水平與TAOC呈正相關(r=0.35，P<0.05)，和對照組呈正相關(r= 0.39，P<0.05)。無玻璃體出血組PDR患者玻璃體液中PEDF水平與對照組和合并玻璃體出血組比較明顯降低(P<0.05)。結論玻璃體液中PEDF水平與TAOC密切相關。PEDF可作為眼內源性抗氧化物并對PDR起到保護作用。

關鍵詞：色素上皮衍生因子； 增殖性糖尿病視網膜病變； 總抗氧化能力

基金項目：國家自然科學基金(81260152); 內蒙古自治區人民醫院科研基金(20110929，20110907)

作者簡介：楊曉靜(1971-)，女，碩士，副主任醫師，研究方向：眼底病變。

中圖分類號：R587.2

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.012

[收稿日期：2014-05-16]

The expression of pigment epithelium-derived factor and total anti-oxidant

capacity in the vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy

YANG Xiaojing1， LU Qiang2， ZHANG Haitao3

(1DepartmentofOphthalmology,InnerMongoliaTraditionalChineseMedicineHospital,

Hohhot010021，China；2DepartmentofOphthalmology，TheInnerMongoliaAutonomousRegion

People′sHospital，Hohhot010017，China；3DepartmentofLaboratory,InnerMongolia

ArmedPoliceHospital，Hohhot010021，China)

Abstract：ObjectiveTo observe the expression of pigment epithelium-derived factor (PEDF) and total anti-oxidant capacity (TAOC) in vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR), and to investigate the relationship between PEDF and TAOC. MethodsVitreous levels of PEDF and TAOC were measured by an ELISA in 20 eyes of 20 diabetic patients with PDR and in 18 eyes of 18 non-diabetic control subjects. ResultsTAOC in vitreous was significantly lower in diabetic patients with PDR than that in control subjects (0.18±0.04 mmol/L vs 0.26±0.05 mmol/L, P<0.01). PEDF levels were positively correlated with TAOC in the vitreous of patients with PDR (r=0.35，P<0.05) and control subjects (r=0.39, P<0.05). Further, PEDF levels in vitreous of PDR patients without vitreous hemorrhage were significantly decreased (P<0.05), compared with those in the control or PDR patients with vitreous hemorrhage (4.1±2.4 μg/mL, 7.4±3.1 μg/mL, 9.1±4.1 μg/mL). ConclusionThe study demonstrates that PEDF is associated with TAOC in vitreous, suggesting that PEDF may act as an endogenous anti-oxidant in the eye and could play a protective role against PDR.

Key words: pigment epithelium-derived factor (PEDF); proliferative diabetic retinopathy (PDR); total anti-oxidant capacity (TAOC)

色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是人及動物眼中天然存在的一種糖蛋白,分子量為50 ku，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serinprotease inhibitor, serpin)基因超家族，但不具有抑制蛋白酶的活性。PEDF首次從培養的人視網膜色素上皮細胞純化出來，具有促進神經元分化的作用[1]。Longeras等[2]研究證明PEDF能抑制細胞和新生血管動物模型中的血管生成，具有抑制內皮細胞生長遷移和抑制缺血誘導的視網膜新生血管形成的作用[3-4]。在糖尿病患者房水和玻璃體中PEDF表達下降，特別是增殖性視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)[5-6]。這些結果表明，眼內PEDF活性的喪失可能促進了PDR的發生。研究發現晚期糖基化終產物可引起眼內氧化應激和血管炎癥反應，從而參與糖尿病視網膜病變(DR)的發病[7-8]。Park等[9]研究發現PEDF能通過抑制活性氧簇(ROS)來抑制視網膜新生血管形成和VEGF的表達。這些結果均提示PEDF可能在PDR中發揮一定作用。然而，在糖尿病視網膜病變患者中玻璃體PEDF水平和總抗氧化能力(total antioxidant capacity ，TAOC)之間的相互關系仍不清楚。本研究對內蒙古自治區中醫醫院眼科住院的20例PDR患者行玻璃體切割術，測定玻璃體液中PEDF和TAOC的水平，并與非糖尿病患者進行比較，旨在探討PDR患者玻璃體液中PEDF與TAOC的關系。

1資料與方法

1.1病例來源選擇內蒙古自治區中醫醫院眼科住院連續PDR患者20例，其中男性14例，女性6例，平均年齡(51±9)歲。糖尿病病程(11±5.8) a，糖化血紅蛋白為(6.8±1.6)%。糖尿病診斷以1997年ADA報告為標準。PDR患者隨機分為兩組：PDR合并玻璃體出血組12眼，PDR無玻璃體出血組8眼。選擇18例患有特發性黃斑裂孔、視網膜前膜的非糖尿病患者作為對照組，其中男性8例，女性10例，平均年齡(59±7.3)歲。

1.2主要試劑與儀器total antioxidant capacity ELISA試劑盒(美國R&D公司)，pigment epithelium-derived factor ELISA試劑盒(美國R&D公司)，無菌試管(美國BD公司)，美國寶特Bio-Tek ELX800光吸收酶標儀，ELISA酶標儀用全自動洗板機(AMW-96SX，日本MedicaTec公司)。

1.3方法所有患者均接受標準的玻璃體切割手術，并于術中獲取未經稀釋的玻璃體液。標本置于無菌試管中并于-80℃保存備用。采用ELISA方法檢測玻璃體液中PEDF和TAOC水平[10]。具體步驟：用包被液稀釋抗原,每孔200 μL，37℃溫育1 h，4℃冰箱放置16～18 h。洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放3 min×3次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。加封閉液200 μL，37℃放置1 h，洗滌3次。加被檢玻璃體液：用稀釋液將被檢玻璃體液進行稀釋，每孔200 μL。同時作稀釋液對照，37℃放置2 h，洗滌3次。加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200 μL, 放置37℃ 1 h，洗滌3次。加底物：鄰苯二胺溶液加200 mL，室溫暗處10～15 min。加終止液：每孔50 μL。觀察結果,用酶聯免疫檢測儀記錄490 nm讀數。

1.4統計學處理采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析，數據以均數±標準差(±s)表示。采用Mann-Whitney U檢驗。PEDF和TAOC相關性采用Spearman相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

與對照組比較,PDR患者玻璃體液中的TAOC明顯降低[(0.18±0.04) mmol/L和(0.26±0.05) mmol/L，P<0.01](圖1)。PDR患者中合并玻璃體出血與無玻璃體出血患者TAOC水平差異無統計學意義[(0.17±0.05)mmol/L和(0.13±0.05) mmol/L，P>0.05]。PDR患者玻璃體液中TAOC與玻璃體液中PEDF水平呈正相關(r=0.35，P<0.05)，和對照組呈正相關(r = 0.39，P<0.05)。PDR患者玻璃體液中PEDF水平與對照組比較，無明顯差異[(7.6±3.2) μg/mL 和(7.4±3.1) μg/mL]。PDR無玻璃體出血組患者PEDF水平為(4.1±2.4 μg/mL)，較對照組的(7.4±3.1) μg/mL和合并玻璃體出血組的(9.1±4.1) μg/mL明顯降低(圖2)。

3討論

本研究結果顯示在PDR患者玻璃體液中TAOC較對照組顯著降低。在PDR患者和對照組中，玻璃體液中PEDF和TAOC呈正相關。研究報道PEDF具有抗氧化特性，能夠抑制糖尿病患者VEGF的表達，認為PEDF可能是一種內源性的抗氧化劑，對PDR發揮保護作用[11-12]。

圖1　TAOC在增殖性糖尿病視網膜病變和對照組中

圖2　PEDF在增殖性糖尿病視網膜病變和對照組中

本研究中PDR合并玻璃體出血患者玻璃體液中PEDF沒有明顯降低，但在PDR無玻璃體出血患者中，玻璃體液中PEDF表達顯著低于對照組，表明玻璃體PEDF在糖尿病視網膜病變中明顯下降，特別是在無玻璃體出血PDR患者中。PDR合并玻璃體出血患者玻璃體液中PEDF的高表達可能是循環血液中PEDF影響了PDR合并玻璃體出血患者玻璃體中PEDF水平表達。在糖尿病視網膜病變中，氧化應激可能參與視網膜PEDF的表達下降，其原因可能是AGEs或H-2O-2促進血管內皮細胞 PEDF基因表達下調[13-14]。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸能夠逆轉高葡萄糖誘導的體外培養的視網膜周細胞PEDF表達減少[15-16]。此外，靜脈注射AGEs誘導的氧化應激也可降低視網膜PEDF的表達。提示糖尿病視網膜病變視網膜中PEDF水平降低，可進一步導致眼內氧化應激反應，從而加重糖尿病性視網膜病變。總之，目前的研究顯示玻璃體中PEDF可作為眼內應激的生物標志之一，對PEDF因子的調節或替代可能成為PDR治療的新策略。

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(本文編輯王艷)