魚肉內源酶對發酵魚糜凝膠特性的影響*

楊方，夏文水

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，210042)

利用生物發酵技術加工及保藏魚糜制品獲得了國內外廣泛的關注［1-4］。通過生物發酵產酸，大多數病原微生物的生長被抑制，產品保質期延長［3］;通過發酵過程中內源酶或微生物產酶對脂肪和蛋白質的水解，產品被賦予了獨特的發酵風味并提高了營養價值［5］;通過發酵產酸，魚肉蛋白交聯形成具有一定強度的有序的凝膠網絡結構，使產品具有彈性和良好的口感［6］。

魚糜制品的凝膠特性決定了其自身質量以及加工特性［7］。現有文獻對加熱及冷藏冷凍過程中，內源酶活變化對魚肉及魚糜產品的凝膠特性的影響有大量報道［8-10］，然而在酸性條件下，酶活變化如何影響魚糜凝膠特性尚不清楚。隨著pH下降，一些內源蛋白酶和交聯酶的活性也發生變化，對凝膠特性產生重要影響。對于蛋白酶，大部分文獻報道認為其破壞了蛋白的骨架結構，從而對凝膠起到劣化作用［7，11］;但也有文獻認為在蛋白酶有限的水解下，部分基團被酶切，從而暴露出更多的疏水基團，疏水相互作用被加強，反而提高了凝膠特性［12］。魚糜內源蛋白酶在發酵過程中的酶活變化對凝膠形成具有積極作用還是消極作用，在何階段發揮主要作用因而有待研究。對于交聯酶，大多數研究集中在谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)上，普遍認為在低溫(4～40℃)放置一段時間，TG酶會催化ε-(γ-Glu)-Lys鍵生成，從而提高魚糜凝膠強度［13］。然而現有資料對TG酶的研究主要是在中性范圍內［10］，發酵過程pH落入酸性范圍，在此條件下其如何作用魚糜凝膠有待研究。

本文選取1株被廣泛應用于魚糜發酵的菌種——植物乳桿菌，以及食品中廣泛應用的酸化劑——葡萄糖酸內酯(GDL)，通過對發酵體系及酸性模擬體系的研究來解決上述問題。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 主要材料

白鰱:2～3 kg/條，鮮活，購于超市。

菌種:植物乳桿菌，由江南大學食品學院提供。

1.1.2 主要試劑

亮抑肽酶、胃酶抑素 A、N-乙基馬來酰亞胺(NEM)，Sigma公司;葡萄糖酸內酯(GDL)，上海綠宙食品添加劑有限公司;青霉素，中諾藥業有限公司;鏈霉素，深圳華藥南方制藥有限公司;兩性霉素B，上海金穗生物科技有限公司;TG酶(120 U/g)，泰興市東圣食品科技有限公司;其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器和設備

SQ2119DX西貝樂食品料理機，上海帥佳電子科技有限公司;T18高速分散機，上海易絲生物科技有限公司;隔水式培養箱、DK-8AXX型電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司;4K-15高速冷凍離心機，德國Sigma公司;Fluoro Max4熒光光譜儀，美國Horiba JY公司;UV-1000分光光度計，上海天美科學儀器有限公司;電泳儀，北京六一儀器廠;電泳槽、ChemiDoc XRS+化學發光凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司;pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;TA-XT2i質構儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩個體系的建立

發酵魚糜體系:(1)蛋白酶測定組:內源酶組配方為100 g魚糜添加2 g NaCl，2.5 g GDL及抗生素(青霉素8000 I.U.，鏈霉素20 mg，兩性霉素 B 50 mg);空白組在上述配方基礎上添加100 μmol亮抑肽酶和1 μmol胃酶抑素A，兩組均放在30℃下保溫48 h;(2)TG酶測定組:內源酶組配方為100 g魚糜添加2 g NaCl，3 g葡萄糖，1 mL活化2次的菌種液(含有107～108CFU的發酵菌)，放在30℃下保溫48 h。菌種活化方法為冷凍保藏菌種在液體MRS培養基中30℃培養24 h。活化菌種4℃冷藏并當天使用。空白組為內源酶組再添加1 mmol NEM。

酸性模擬體系:肌原纖維蛋白中加入質量分數為2%的NaCl，2.5%的GDL后，與內源蛋白酶粗酶液在40 ℃下反應，通過在不同時間(0、10、20、30、45 min，1、2、4 h)對8組樣品添加1 mmol/L(最終濃度)亮抑肽酶和10 μmol/L胃酶抑素A終止水解進行，4 h后取出所有樣品，4℃冷藏，隔天進行質構及電泳分析。肌原纖維蛋白提取方法參照文獻方法［6］。內源蛋白酶粗酶液提取方法參照Sovik［14］法。

1.2.2 pH測定

參照文獻方法［15］。

1.2.3 蛋白酶酶活測定方法

參照Sovik［14］法。1個蛋白酶活力單位(U)定義為在30℃下每克粗酶液中的水溶蛋白每小時水解釋放1 mg多肽。多肽含量由Lowry［16］法測定。粗酶液中水溶蛋白含量由雙縮脲法［17］測定，以牛血清蛋白繪制標準曲線。

1.2.4 TG酶酶活測定方法

發酵魚糜加入質量濃度為4倍的提取緩沖液(5 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，3 mmol/L DTT，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)均質后，用冷凍離心機16 000 g離心20 min后取上清液得粗酶液。測定時，2 mL粗酶液加入2 mL反應液(2 mg/mL N，N-二甲基化酪蛋白，30 μmol/L單丹磺酰尸胺，5 mmol/L CaCl2，3 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)在37℃下反應10 min后，在激發波長(350 nm)和發射波長(480 nm)下測定熒光值。

1.2.5 凝膠強度測定方法

將樣品修整為相同尺寸(12 mm i.d.×20 mm)，使用球形探頭(P/0.25S)做凝膠破斷實驗。測前、中、后的速度為10 mm/s，觸發力為5 g，形變量為80%，凝膠強度表示為破斷力(g)×凹陷深度(mm)。

1.2.6 電泳測定方法

結合 Balage［18］法和 Laemmli［19］法并稍有改進。即，2 g樣品加入18 mL質量濃度為50 g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，在100℃下煮1 h后，收集12 000 g離心20 min后的上清液，調整蛋白質量濃度為4 mg/mL后，與上樣緩沖液混合(0.125 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，20% 甘油，10% β-巰基乙醇，0.005%溴酚藍)。該混合液煮沸5 min后采用4%濃縮膠，10%分離膠進行電泳實驗。電泳電壓維持在100 V。染色液為0.125%考馬斯亮藍R250、25%甲醇和10%乙酸，染色3 h;脫色液為40%甲醇和10%乙酸，脫色1～2 h。

1.2.7 蛋白聚集狀態對蛋白酶水解蛋白效率的影響的分析方法

建立3組:(1)pH 4.3蛋白聚集前組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白用HCl調至4.3后，立即與內源蛋白酶粗酶液40℃下反應;(2)pH 4.3蛋白聚集后組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白加入質量濃度2.5%的GDL在4℃平衡4 h后與酶液40℃下反應;(3)pH 7.0組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白pH調至7.0后，立即與酶液40℃下反應。比例為10 g蛋白加1 mL酶液。TCA可溶解性肽測定方法參照文獻方法［15］。實驗(2)組0 min取出的樣品測定值已扣除4 h平衡過程中酸水解增加的肽含量值。

1.2.8 非二硫共價鍵測定方法

由于內源TG酶較少會導致測定系統誤差偏大，所以添加質量濃度為0.25%外源TG酶進行測試。用上述方法提取的肌原纖維蛋白溶液分別添加0、0.25%、1%、1.5%、2.5%、3%GDL在30℃下放置24 h后，使pH分別達到6.91、6.13、5.53、4.89、4.51、4.18，測定此時非二硫共價鍵的生成比例。添加蛋白酶抑制劑和抗生素(濃度見上)抑制蛋白酶和微生物作用。

測定方法參照文獻方法［6］稍作修改如下，稱量魚糜凝膠質量，記為w1，離心管質量記為w0。魚糜凝膠加入質量濃度為5倍的溶液(0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巰基乙醇)均質后，在4℃下攪拌30 min，混合液14 000 g離心20 min后倒去上清液，真空干燥至恒重(＜0.02 g)后，稱取沉淀和離心管總質量w2。

1.2.9 數據處理

圖表由OriginPro 8.6繪制，數據分析采用SPSS 18.0，顯著性差異定義為P＜0.05。

2 數據與分析

2.1 發酵階段內源酶酶活變化

2個發酵體系的pH都從最初的7.0附近下降到4.3附近(表1)，分別是由GDL緩慢釋酸和乳酸菌產酸造成的［20］。研究內源蛋白酶時，因為植物乳桿菌也具有一定的產蛋白酶能力，所以利用GDL產酸代替乳酸菌產酸;研究內源TG酶時因為乳酸菌不產TG酶，因此采用原態發酵體系，減少系統誤差。

由表1可得，發酵期間內源蛋白酶總酶活逐漸增加，且前12 h變化劇烈，與此階段迅速下降的pH相對應。說明pH的變化對內源總蛋白酶活的影響顯著;在發酵階段，酸性蛋白酶為關鍵酶類，且活性較高。表1中，空白組的蛋白酶抑制劑對酸性蛋白酶的酶活抑制率達85%以上，驗證了水解實驗中該抑制劑組可作為水解反應終止劑的可行性。從表1還可以看出，發酵期間內源TG酶酶活力降低，與其是中性蛋白酶有關［7］，因而其在酸性條件下容易失活。10 mmol/kg NEM對酶活的抑制率在53% ～70%，與其他文獻報道類似［21］。

表1 發酵階段pH及內源酶酶活變化Table 1 The change of pH and endogenous enzymatic activities during fermentation

2.2 不同水解程度對酸誘導凝膠特性的影響

肌原纖維蛋白是魚肉肌肉蛋白中的重要組成部分，其凝膠特性與魚糜的凝膠特性密切相關。因而理解內源蛋白酶對肌原纖維蛋白的水解與其凝膠特性的聯系具有重要意義。由表2可得，該酸性模擬體系的pH變化與發酵體系的pH變化相差不大，可以用此模型理解發酵體系。

表2 酸性模擬體系pH和凝膠強度的變化Table 2 The change of pH and gel strength in the GDL acidified system

在水解初期(30 min以內)，水解時間增加沒有使凝膠強度加強，說明適度的內源蛋白酶水解不能增強凝膠強度。雖然酶切作用可能使蛋白暴露更多的疏水基團，但是隨著pH下降，逐漸靠近肌原纖維蛋白等電點，蛋白正負電荷中和，斥力起主導作用，加之內源蛋白酶的酶切位置沒有形成合適的距離，導致暴露的疏水基團之間沒有形成疏水相互作用，從而沒能增加凝膠強度。隨著酸的釋放，水解時間增長，凝膠強度下降。然而，這一改變是由于pH下降對蛋白酶的激活作用，還是肌原纖維蛋白隨pH發生構象改變形成對蛋白酶水解有利的構象還不清楚，將在下面實驗進行補充說明。

由圖1可知，肌球蛋白重鏈(MHC)的降解是造成凝膠強度下降的主要原因。肌動蛋白(Actin)在酸性體系水解完畢后只有輕微降解。Montero［22］等也認為，MHC的交聯與蛋白凝膠強度的增加存在正相關。

2.3 內源蛋白酶影響凝膠強度的機理初步探究

圖1 酸性模擬體系水解時間對肌原纖維蛋白的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on myofibrillar protein in the GDL acidified system

上述實驗說明了內源蛋白酶對凝膠的劣化作用，然而由于體系pH的下降會同時造成酸性蛋白酶的激活和蛋白質構象的改變，因而無法說明哪種因素為主要因素。圖2實驗結果解決了這一問題。由圖可知，內源蛋白酶對沒有進行酸性平衡的組(pH 4.3蛋白聚集前)和進行過酸性平衡后的組(pH 4.3蛋白聚集后)的水解效率沒有顯著差異，而pH不同組(pH 4.3蛋白聚集前和pH 7.0組)的水解效率卻有顯著差異。說明pH改變是造成內源蛋白酶影響發酵魚糜凝膠特性的主要因素，蛋白質構象的改變在這個過程中起到的作用較小。

圖2 pH和蛋白聚集對內源酶水解的影響Fig.2 Effect of pH and aggregation of protein on hydrolysis efficiency

2.4 酸性條件下TG酶對凝膠特性的影響

比較圖3的空白組和內源酶組發現，兩者的差異隨著發酵時間的進行而減小，說明TG酶對蛋白的交聯作用主要集中在發酵前期，在發酵后期交聯能力變弱。

圖3 TG酶在酸性條件下對凝膠強度的影響Fig.3 Effect of TGase on gel strength in the GDL acidified system

NaCl、尿素及β-巰基乙醇的混合試劑可以破壞離子鍵、氫鍵、疏水相互作用以及二硫共價鍵，但無法破壞非二硫共價鍵［23］。由圖4可知，在中性范圍附近(6.1～7.0)，TG酶組和空白組差異顯著，但在酸性范圍內(4.2～5.5)，差異變小。這說明在中性范圍內，主要是由TG酶生成了ε-(γ-Glu)-Lys鍵，而在酸性范圍內，是由其他因素導致了其他非二硫共價鍵的生成。

圖4 不同酸性條件對非二硫共價鍵生成的影響Fig.4 Effect of pH on production of non-disulphide covalent bonds

3 結論

發酵魚糜內源蛋白酶活力在發酵階段逐漸增加，主要在后期對魚糜凝膠起劣化作用;pH對內源蛋白酶的激活作用是造成凝膠劣化的主要因素;TG酶活力在發酵階段逐漸降低，主要在前期增強了魚糜凝膠強度;pH降低會減弱TG酶作用，但會誘導其他非二硫共價鍵的生成。本文闡明了發酵魚糜內源酶酶活變化、對凝膠的作用效果、作用時期及原因，對后續開展如何控制內源酶活，提高發酵魚糜制品的凝膠特性的工作具有一定指導意義。

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