纖維素酶法制備馬鈴薯渣可溶性膳食纖維的理化及功能性質*

程力，張獻梅，顧正彪，3，洪雁，3，李兆豐，3，李才明

1(江南大學 食品學院，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(食品安全與營養協同創新中心，江蘇無錫，214122)

膳食纖維被稱為是繼水、蛋白質、脂肪、碳水化合物、礦物質、維生素之外的“第七大營養素”，是指在人體小腸內不能被消化吸收，而在人體大腸能部分或全部發酵的植物性成分、非淀粉類碳水化合物，包括多糖、寡糖、木質素以及相關的植物物質［1］。根據膳食纖維溶解性的不同，可將其分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)兩大類［2］。研究證實，IDF 主要作用在于使腸道產生機械蠕動，加速腸道排空，生理活性較弱，沒有明顯的保健作用;而SDF則更多的是發揮新陳代謝的功能，比如參與和影響碳水化合物和脂類代謝［3］。

馬鈴薯渣含有淀粉、纖維素、果膠及少量蛋白質等可利用組分，是一種富含膳食纖維的馬鈴薯淀粉加工副產物，且其中的SDF含量較高，具有很高的開發應用價值。傳統的酶法制備的馬鈴薯渣膳食纖維(potato pulp dietary fiber，PDF)中淀粉殘存量高，影響了PDF的品質，限制了其應用范圍，而利用馬鈴薯渣直接制備SDF并對其理化功能性質的研究極為有限。

研究團隊的前期工作表明，馬鈴薯渣中的纖維素易被纖維素酶降解，且淀粉由于纖維素組分的包裹和阻隔較難被酶水解利用。因此，本研究通過采用纖維素酶改性馬鈴薯渣，提高SDF含量，解除其對淀粉的包裹作用，再利用酶法去除淀粉制備了可溶性膳食纖維(C-SDF)。在此基礎上，對C-SDF的理化及功能性質進行表征，并與市售的可溶性膳食纖維(S-SDF)和傳統酶法制備PDF進行對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濕馬鈴薯渣，內蒙古奈倫集團股份有限公司提供;α-高溫淀粉酶(酶活力2 000 U/mL)、葡萄糖苷淀粉酶(酶活力100 000 U/mL)、纖維素酶(酶活力70 U/mL)，購于 Sigma-Aldrich集團;胰脂肪酶(酶活3 000 U/g)，購于上海沃凱藥業有限公司;葡萄糖試劑盒，購于北京利德曼生化股份有限公司;其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博泰實驗設備有限公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司;AR-G2型流變儀，美國TA公司;ICS-5000型高效陰離子交換色譜，美國Dionex公司;Waters 1525型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 纖維素酶制取馬鈴薯渣可溶性膳食纖維的工藝

［4］的方法，并綜合考慮SDF的得率和質量，調整傳統制備工藝，以濕馬鈴薯渣為原料，首先采用纖維素酶對馬鈴薯渣進行改性，一定程度的破壞纖維素的網狀結構，降低其對淀粉溶出糊化的阻礙，然后再去除淀粉。傳統制備工藝首先去除淀粉，再用纖維素酶、木聚糖酶改性，根據馬鈴薯渣組分酶解特性的研究結果，未經處理的馬鈴薯渣淀粉酶法降解率低，殘存量大，在經纖維素酶、木聚糖酶處理后被束縛的未降解的淀粉會進一步溶出糊化，經后續醇沉工序將混到SDF中，影響SDF的品質。因此，調整傳統制備工藝，旨在既有利于淀粉的去除又避免了傳統工藝后續流程中淀粉的進一步溶出，影響SDF的品質。具體工藝及條件如下:

稱量一定量的濕馬鈴薯渣，按薯渣∶水=1∶5混勻，1 mol/L HCl調節pH至4.5，纖維素酶酶添加量為20 U/g、溫度50℃，酶解時間4 h，反應結束后沸水浴中滅酶10 min;1 mol/L NaOH調節pH至5.0，加入α-高溫淀粉酶，95℃反應1 h;1 mol/L鹽酸調節pH至5.0，加入葡萄糖苷淀粉酶，60℃反應30 min，沸水浴中滅酶10 min;真空抽濾后得到的濾液，用旋轉蒸發儀濃縮;濃縮后的濾液，加4倍體積沉淀SDF，室溫下放置過夜;4 500 r/min離心5 min分離，95%乙醇洗滌3次;置于電熱鼓風干燥箱中50℃干燥12 h，即得 SDF。采用此條件制得的 C-SDF得率達31.94%(質量分數)，占總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)含量的62.93%(質量分數)。

1.2.2 單糖及半乳糖醛酸的測定

分別稱取樣品C-SDF和S-SDF各(100±10)mg于2支試管中，每支試管加入(1.00±0.10)mL 72%的H2SO4，攪拌1 min，在30℃水浴中水浴(60±5)min，每隔5～10 min攪拌1次，使其充分水解;然后加入(28.00±0.04)mL去離子水，使H2SO4稀釋到4%，混合均勻，密封好后置于壓力鍋中，于121℃反應60 min，反應結束后冷卻至室溫;然后取100 μl的水解液于小試管中，加去離子水稀釋，最后定容到10 mL采用ICS-5000離子色譜儀測定［5］。色譜柱:CarboPac PA20;檢測器:脈沖安培檢測器，流速 0.5 mL/min。

1.2.3 紅外光譜測定

取適量的KBr和樣品，研磨充分，壓片法制備薄片，使用傅立葉紅外光譜儀測試。條件如下:以空氣為參比，掃描波數范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數為32次，通過Omnic8.0軟件分析結果［5］。

1.2.4 分子質量分布測定

分別準確稱取0.100 0 g C-SDF和S-SDF，溶于去離子水中并定容至25 mL，過0.45 μm尼龍微孔膜，濾液采用Waters 1525高效液相色譜儀測定。色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmin×2;流動相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.9 mL/min;柱溫45℃。

1.2.5 黏度測定

樣品制備方法:使用去離子水溶解C-SDF和SSDF樣品，質量分數為5%(以干基計)，攪拌均勻使其充分溶解。

取上述方法制成的樣品溶液置于流變儀上，測試條件如下:2.0 cm平板，間隙1 mm，溫度設為25℃，測定樣品在剪切速率(γ)為0～100 s-1內黏度及剪切應力的變化［6］。

1.2.6 葡萄糖透析延遲指數的測定

測定方法參考 Cheickna Daou［7］和黃清霞等［8］的方法，分別在30、60、90 min時測定透析液中葡萄糖含量。葡萄糖透析延遲指數(GDRI)的計算［公式(1)］:

1.2.7 α-淀粉酶活力抑制力的測定

測定方法參照文獻［9］，淀粉酶活力抑制力以還原糖減少量的百分比計，計算公式(2):

式中:A—空白樣中未添加樣品時反應所測得的還原糖的含量，g/100g;A1—添加樣品反應后所測得的還原糖的含量，g/100g。

1.2.8 膽酸鈉的體外吸附測定

測定方法參照文獻［10］。

1.2.9 胰脂肪酶活力抑制力的測定

測定方法參照文獻［9］，脂肪酶活力的抑制力定義為自由脂肪酸產生量與對照相比降低的百分率;計算公式(3):

式中:V0—不加樣品時，所消耗的NaOH體積，做為對照，mL;V—滴定所消耗的NaOH溶液的體積，mL。

1.2.10 數據處理

實驗數據采用Origin 8.5進行圖形處理;采用SPSS 19.0進行數據統計分析，顯著性分析采用Ducan’多重檢驗(P＜0.05);數值均以(均值±標準差)表示，實驗中所涉及數據平行測定至少3次。

2 結果與討論

2.1 C-SDF的理化性質研究

2.1.1 單糖組成分析

由表1可知，C-SDF中半乳糖醛酸含量最高，葡萄糖和半乳糖次之，其次是阿拉伯糖和鼠李糖，木糖含量極低，初步分析C-SDF中主要成分為果膠和聚葡萄糖;S-SDF中僅含有葡萄糖和半乳糖，且葡萄糖含量高達83.43%，初步分析S-SDF屬于聚葡萄糖類可溶性膳食纖維［10］。

表1 C-SDF和S-SDF的單糖組成及半乳糖醛酸含量Table 1 The neutral monosaccharide content ratio and Gal A of SDF

2.1.2 紅外光譜掃描分析

由圖1可知，C-SDF、S-SDF和PDF都具有糖的特征吸收峰。1 600～1 800 cm-1處的吸收峰是C=O的吸收峰，說明樣品中都存在糖醛酸;1 739 cm-1處為半纖維素羰基(C=O)的伸縮振動，說明在C-SDF中存在可溶性的半纖維素成分，但吸收峰很弱說明可溶性的半纖維素含量極少，PDF中此處吸收峰很強，說明半纖維素含量相對較高;895～899 cm-1處的吸收峰是由β-吡喃糖C-H變角振動引起的，說明SDF中存在 β-吡喃糖［11］。

圖1 馬鈴薯渣中各組分傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of potato pulp’s composition

2.1.3 分子質量分布分析

由表2可知，C-SDF的重均分子質量(Mw)分布集中在266～137 687 Da，其中最大Mw為137 687 Da，與果膠的Mw 125 111 ～146 841 Da基本相符［12-13］，進一步證明C-SDF中含有果膠，可能還含有可溶性的纖維素或半纖維素片段;而S-SDF的Mw分布集中在445 Da和1 695 Da，其中 Mw為445 Da的部分所占比例為52.87%，Mw為1 695的部分占47.13%。

表2 C-SDF和S-SDF相對分子質量分布Table 2 Relative molecular weight distribution of C-SDF and S-SDF

2.1.4 黏度分析

SDF的黏度對其生理功能有重要影響，相對較大的黏度有利于延緩和降低消化道中其他食物成分的消化吸收，有利于SDF發揮其降血糖和降血脂作用，有研究表明只有高黏度的SDF才對預防或治療高膽固醇病有預防作用［14］。C-SDF和S-SDF的靜態流變曲線如圖2所示。

圖2 C-SDF和S-SDF的黏度Fig.2 The viscosity of C-SDF and S-SDF

采用Herschel–Bulkley方程對曲線進行擬合，結果如表3所示。由表中擬合參數可知，C-SDF的屈服應力σ0和稠度系數K值均大于S-SDF的σ0和K。這主要是由SDF分子質量大小導致的，C-SDF相對較高的黏度性質，將賦予其較好的降血糖、降血脂的功能性質。

表3 C-SDF和S-SDF的Herschel–Bulkley擬合參數Table 3 Rheological parameters of C-SDF and S-SDF

2.2 C-SDF的功能性質研究

2.2.1 葡萄糖透析延遲指數分析

葡萄糖透析延遲指數(GDRI)可以有效反映葡萄糖在胃腸道被延遲吸收的情況，通過測定糖透析延遲指數可以評價膳食纖維降低餐后血糖的能力［15］。

從圖3可以看出C-SDF的葡萄糖延遲擴散能力均顯著高于S-SDF和PDF(P＜0.05)，這可能是經纖維素酶作用得到的SDF中由于酶對細胞壁的部分降解作用，使得部分纖維素可溶的同時纖維結構變得較疏松，比表面積增大，暴露出來的功能基團增多，CSDF與葡萄糖分子間的相互作用增強，并且C-SDF較好的溶解性使它與葡萄糖之間的接觸吸附更加充分;PDF結構致密，錯綜復雜的纖維結構阻礙了功能基團與酶的接觸，無法發揮作用;Adiotomre等［16］報道多糖黏度對葡萄糖在腸道吸收的延遲程度具有很大影響，S-SDF則由于黏度較小及功能成分的不同，葡萄糖延遲擴散能力低于C-SDF。

圖3 C-SDF、S-SDF和PDF的葡萄糖透析延遲指數Fig.3 GDRI of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.2 α-淀粉酶活力抑制力

膳食纖維對α-淀粉酶活力的抑制作用是其降血糖功能的另一作用機理。淀粉酶活力受到抑制后淀粉的酶解受到限制，被水解成小分子糖的量變小，使得血糖水平降低。綜合分析C-SDF對α-淀粉酶活力的抑制作用和它的葡萄糖延遲擴散能力有助于進一步從機理上解釋其降血糖原因。

由圖4可知，C-SDF對α-淀粉酶活力的抑制力高于PDF和S-SDF，但三者之間無顯著差異(P≥0.05)。研究報道顯示膳食纖維對淀粉酶活力抑制作用的機理包括:膳食纖維對淀粉酶或淀粉的束縛作用阻礙了底物對酶的可及性，以及膳食纖維的表面基團對淀粉酶活力的抑制作用［17］。PDF表現出了較大的α-淀粉酶活力抑制力，可能是其中復雜的纖維素和半纖維素結構，對淀粉或淀粉酶的束縛作用大于C-SDF增加的活性基團對淀粉酶活力的抑制作用;S-SDF的組成結構簡單黏度較小，具有最小的淀粉酶活力抑制力［18］。

圖4 C-SDF、S-SDF和PDF的淀粉酶活力抑制力Fig.4 α-Amylase inhibitory activity of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.3 膽酸鈉的體外吸附分析

膳食纖維對膽酸鈉的吸附能力可以用來衡量其降血脂的功能特性，膳食纖維通過在小腸中束縛膽酸鹽及促進膽酸鹽的排出來降低膽固醇，間接發揮降血脂功效［19］。膳食纖維可以通過疏水相互作用、范德華力和氫鍵等與膽酸鹽發生相互作用，或以其中一種作用力為主，實現對膽酸鹽的吸附、促進膽酸鹽的排出，發揮降血脂的作用［20］。

由圖5可知，溶液中膽酸鈉濃度隨時間的推移而不斷減小，說明溶液中的膳食纖維持續的發揮著吸附膽酸鈉的作用。C-SDF在最開始的30 min內，膽酸鈉濃度變化較為顯著，30～45 min時略微減慢，而后則趨于平緩;S-SDF在最開始的15 min內，膽酸鈉濃度變化較為顯著，15～60 min變化緩慢，之后區域平緩;PDF在最開始的15 min內，膽酸鈉濃度變化較為顯著，15～30 min內略微減慢，而后則趨于平緩。CSDF趨于平緩的極限值低且趨于平緩所用時間長，說明C-SDF可以較長時間發揮吸附膽酸鈉的作用且吸附能力較強。

圖5 C-SDF、S-SDF和PDF的膽酸鈉吸附力Fig.5 The bile sodium adsorbility of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.4 胰脂肪酶活力抑制力分析

膳食纖維對胰脂酶活力的抑制作用可作為它降血脂的另一表征。由膳食纖維引起的脂肪水解率的降低是非常有利的，脂肪水解率降低會延長餐后飽腹感的時間并且減輕脂肪消化系統的負擔［21］。

由圖6可知，C-SDF的胰脂肪酶活力抑制力顯著高于S-SDF和PDF。推測其原因C-SDF中因酶的作用纖維片段變小，比表面積增大，功能集團更多地暴露出來，使其對油或酶的包囊作用增大，限制了油對酶的可及性，從而降低了胰脂酶的活力。而PDF因結構致密，大部分功能集團被束縛在纖維結構內部，阻礙了其與油或酶的接觸，限制了其對胰脂肪酶活力的抑制作用［22］。

圖6 C-SDF、S-SDF和PDF的胰脂酶活力抑制力Fig.6 Pancreatic lipase inhibitory activity of C-SDF，S-SDF and PDF

3 結論

C-SDF的單糖組成中半乳糖醛酸含量最高，其次是葡萄糖和半乳糖，紅外光譜顯示它屬于多糖類物質且有明顯的糖醛酸類物質吸收峰，分子質量分布顯示其最高Mw與果膠的分子質量分布基本一致，C-SDF的主要成分為果膠和β-葡聚糖;C-SDF因含有果膠，分子質量和黏度值均高于S-SDF;C-SDF的葡萄糖延遲擴散能力、α-淀粉酶活力抑制力、膽酸鈉的吸附能力和胰脂肪酶活力抑制力均高于PDF和S-SDF，在降血糖、降血脂方面將具有廣泛的用途。

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