響應面優化大孔吸附樹脂分離純化茼蒿總黃酮*

陳建中，葛水蓮，昝立峰，王更先，邢浩春，付靜

1(邯鄲學院 生命科學與工程學院，河北邯鄲，056005)2(冀南太行山區野生資源植物研發中心，河北邯鄲，056005)

研究表明，黃酮類物質具有抗癌、抗病毒，調節免疫力、治療心腦血管疾病、骨質疏松和糖尿病并發癥等多種生理活性藥用作用［1-2］。茼蒿(Chrysanthemum coronarium L.)又名蓬蒿，是菊科茼蒿屬1年或2年生草本植物。其莖葉可作為蔬菜食用，亦可入藥。《中藥大辭典》記載，茼蒿有“和脾胃、消痰飲、安心神”之功效，性味甘、辛、平，無毒，清利頭目，利小便［3］。

大孔吸附樹脂具有比表面積較大、吸附純化效率高、物理吸附污染低、溫度穩定性高等特點［4-5］。因而近幾年在中草藥有效成分提取和天然產物的分離純化中被廣泛應用［6-7］。有關茼蒿總黃酮(TFC)純化工藝的研究并不多見，試驗以TFC的吸附量和回收率為指標，通過單因素試驗和響應面優化試驗考察5種大孔吸附樹脂對TFC的靜態、動態吸附和解吸附性能，以篩選大孔樹脂純化TFC的最佳工藝。

1 材料方法

1.1 材料試劑儀器

材料:茼蒿于開花前采集地上部分，采時株高多20～40 cm，為冀南太行山區野生種類，采集地上部分。材料去掉雜質、洗凈塵土、瀝干水分，再于60℃鼓風干燥箱中烘至恒重，粉碎過40目篩后備用。

試劑:無水乙醇、蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均為分析純。

試驗儀器及設備:小型自動粉碎機(鄭州市烽火機械設備有限公司)，L5紫外可見分光光度計(日本島津儀器公司)，N-1100V-WP旋轉蒸發儀(西安安泰儀器公司)。

1.2 標曲繪制與TFC濃度測定

標曲繪制:參考江敏［8］、田徽［9］等人的方法，根據試驗數據得出，吸光度(Y)和濃度(X)的回歸方程:Y=9.12X-0.023，R2=0.998 6，線性回歸關系良好。黃酮含量測定:吸取樣品液1 mL，用體積分數(下同)70%乙醇補至5 mL，加入質量分數 5%NaNO20.3 mL，搖勻置6 min;再加入質量分數10%Al(NO3)30.3 mL，搖勻置6 min;加質量分數4%NaOH 4 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻15 min后測定吸光度，重復3次求均值［10］。

1.3 大孔吸附樹脂靜態分離純化試驗

1.3.1 大孔吸附樹脂的預處理

取樹脂適量，95%乙醇完全浸泡24 h，去除大孔樹脂碎片及雜物。采用濕法裝柱，用95%乙醇反復洗滌，直至水與流出液不產生白色渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味;接著先后用體積分數5%的HCl與質量分數2%的NaOH反復淋洗，并靜止置2～4 h后，用蒸餾水洗至pH值中性，浸泡于蒸餾水中備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂靜態吸附-解吸性能試驗

在25℃下精確稱取經預處理的5種大孔樹脂5.00 g，分別置于250 mL磨口三角錐形瓶中，精密加入濃度2.56 mg/mL的 TFC100 mL，每隔15 min振搖20 s持續2 h，使其充分吸附至吸附平衡，精密移取剩余樣液適量測定其吸光度值，計算吸附前后黃酮質量濃度的變化;將吸附至飽和狀態的樹脂另置于250 mL錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，每隔10 min振搖20 s，振搖2 h，精密吸取上層液測定吸光度值，計算各樹脂的吸附量，解吸附率和回收率。

吸附量/(mg·g-1)=(c0-c1)V/M

吸附率/%= ［(c0-c1)/c0］×100

解吸率/%=［c2/(c0-c1)］×100

回收率/%=(c2/c0)×100

式中:c0為吸附液中黃酮質量濃度，mg/L;c1為吸附后溶液黃酮質量濃度，mg/L;c2為解吸液中黃酮質量濃度，mg/L;M為干樹脂的吸附量，mg/L;V為吸附液體積，mg/L［11］。

1.4 大孔樹脂動態吸附-解吸性能優化試驗

1.4.1 大孔樹脂上樣液的泄露曲線測試

準確稱取經預處理的大孔樹脂5.00 g進行動態吸附，取上樣溶液黃酮濃度為2.56 mg/mL，以1 mL/min的流速上樹脂柱。分段收集流出液，每份10 mL，收集30份，以編號為橫坐標，以黃酮含量為縱指標，繪制泄漏曲線，流出液中黃酮濃度達到上柱液濃度的10%時，稱為泄漏點，當流出液中黃酮濃度達到上柱液濃度的100%時，稱為飽和點［12］。

1.4.2 上樣質量濃度對樹脂吸附的影響

取7份2.56 mg/mL的TFC提取液，加水稀釋至0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 和 2.00 mg/mL，分別加入D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速通過，95%乙醇洗脫，測定流出液中黃酮濃度。

1.4.3 上樣液pH對樹脂吸附的影響

取6份1.00 mg/mL的TFC 50 mL，分別用酸或堿將 pH 值調至 4、5、6、7、8、9，分別加入 6 根 D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速過柱吸附，95%乙醇溶液進行反復洗脫，測定流出液的黃酮含量。

1.4.4 大孔樹脂洗脫曲線的測定

稱取經預處理的D-101大孔樹脂5.00 g，取已知質量濃度的黃酮溶液以1 mL/min的流速通過進行動態吸附，待樹脂達到完全吸附平衡后，用95%的乙醇以以2 mL/min的流速進行洗脫，分段收集洗脫液，每份收集10 mL，分段測定洗脫液中黃酮含量，繪制洗脫曲線［13］。

1.4.5 大孔樹脂洗脫劑濃度對解吸附的影響

取5份質量濃度0.50 mg/mL TFC提取液各50 mL，分別加入5根D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速吸附，用55%，65%，75%，85%，95%的乙醇洗脫，測定流出液其中黃酮含量［14］。

1.4.6 洗脫流速對大孔樹脂解吸附的影響

取質量濃度為0.5 mg/mL黃酮粗提液50 mL，加入D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速通過后，各用95%乙醇以 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min 進行洗脫，測定流出液的黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂靜態和動態解吸附性能測試

2.1.1 大孔吸附樹脂的篩選

試驗測定5種性質不同的樹脂進行靜態吸附和解吸附試驗，茼蒿黃酮的吸附量，解吸率和回收率數據結果見表1。

表1 大孔吸附樹脂靜態吸附性能Table 1 Static adsorption properties of macroporous resins

從表1可以看出，TFC吸附量較大的是D-101和AB-8，其次是 DA-201，SD-401 和 DM-301，解吸附率最強的是D-101和AB-8，結合回收率數據，D-101樹脂吸附解吸附特性優于其他樹脂。

2.1.2 D-101大孔樹脂泄露曲線測試

圖1表明，隨著進樣液體積的增加，流出液中黃酮的濃度逐漸增加。當上柱體積為60 mL時，流出液中黃酮濃度達到0.256 mg/mL，初始上樣液黃酮濃度的10%，為大孔吸附樹脂D-101的泄露點，所以上柱體積控制在60 mL為宜。當上樣液體積逐漸增加，大孔吸附樹脂D-101的吸附量逐漸趨于飽和，當樣液達到210 mL時，此時流出液黃酮濃度2.56 mg/mL已和上樣液相近，該體積為大孔吸附樹脂D-101的吸附量的飽和點。

圖1 D-101樹脂吸附茼蒿黃酮的泄露曲線Fig.1 Leakage curve of TFC on D-101

2.1.3 上樣濃度對D-101大孔樹脂吸附性能的影響

圖2所示，在低質量濃度區間內，隨著進樣濃度的增加，樹脂吸附量和回收率都在增大，在進樣濃度為1.00 mg/mL時，樹脂達到最大吸附量，之后吸附量基本上保持不變，但當質量濃度大于1.0 mg/mL后，樹脂回收率反而下降，這是因為進樣質量濃度大于樹脂的吸附飽和度造成。而且進樣質量濃度過高，將導致樹脂再生次數的增加，縮短樹脂使用周期，所以進樣液初始質量濃度1.00 mg/mL為宜。

圖2 上樣質量濃度對D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of concentration on adsorptionof D-101

2.1.4 上樣pH對D-101大孔樹脂吸附性能的影響

由圖3可知，TFC吸附量和回收率都隨pH變化明顯，當pH值大于6時回收率大于吸附量，當pH=6時回收率和吸附量都達到最大值，且隨著pH值繼續升高兩者都呈下降趨勢，當pH≥7時，粗提液會出現沉淀。因此上樣液酸堿度選擇pH=6比較適宜。

圖3 上樣pH對D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of pH on adsorption of D-101

2.1.5 D-101大孔樹脂洗脫曲線的測定

如圖4所示隨著洗脫劑用量的增加洗脫液中TFC濃度在不斷增加，當洗脫劑為40 mL時，洗脫液TFC濃度達到極大值，隨著洗脫劑用量的增加，TFC濃度在逐漸降低，洗脫劑為80 mL時，黃酮含量降低至最低值，洗脫液中TFC不足0.01 mg/mL，說明大孔樹脂吸附的TFC基本被洗脫完畢。綜合考慮洗脫峰單一，對稱，尖銳，沒有明顯的拖尾現象，表明95%乙醇80 mL可將TFC完全洗脫下來。

圖4 D-101大孔樹脂的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of D-101 macroporous resin

2.1.6 洗脫劑濃度對D-101解吸附性能的影響

由圖5可得，當乙醇體積分數≤75%時，隨著體積分數的增加，解吸率和回收率二者逐漸增大，當乙醇體積分數＞75%時，二者皆呈下降趨勢。擁有多酚結構和糖苷鍵的黃酮類化合物在水溶液中極性較弱，易被乙醇從樹脂中洗脫。當乙醇體積分數太高時，將大部分雜質也一起洗脫。因此確定洗脫劑遺傳的體積分數75%為宜。

圖5 洗脫濃度對D-101大孔樹脂解吸附率的影響Fig.5 Effect ofeluent concentration on desorption rate of D-101

2.1.7 洗脫流速對D-101解吸附性能的影響

圖6 洗脫流速對D-101大孔樹脂解吸附性能的影響Fig.6 Effect ofelution flow speed on desorption rate of D-101

如圖6所示，隨著洗脫劑流速的增加，大孔樹脂的解吸率和回收率都在不同程度的下降，特別當＞3 mL/min時，回收率較解吸率下降快速且明顯。當洗脫速率1.0 mL/min時洗脫效果好，而在洗脫速率＞3.0 mL/min解吸率下降曲線平緩，而回收率下降明顯從63.25%下降到44.95%。綜合考慮生產周期和回收率確定洗脫速度2.0 mL/min為宜。

2.2 響應面試驗優化分析

2.2.1 響應面試驗設計

依據中心組合(Box-Benhnken)試驗設計原理，做四因素三水平共29個試驗點(5個中心點)的響應面分析試驗。表2中29個試驗點可分為兩類:一類是自變量A、B、C、D取值在各水平所構成的三維析因點，共計24個;一類是區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。A(上樣濃度，mg/mL)，B(上樣 pH)，C(洗脫濃度，%)，D(洗脫流速，mL/min)為自變量，TFC回收率為響應值Y(指標值)［15］。

表2 響應面試驗方案及試驗結果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 響應面曲面方差分析

由表3分析可知，(P=0.047＜P=0.05)二次回歸方程模型顯著，失擬項不顯著(P=0.428＞P=0.05)。通過該模型的方差分析可知:上樣pH(B)對TFC回收率影響差異顯著(P=0.047)，而上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)和洗脫速度(D)3個因素對TFC回收率影響差異不顯著。四因素對TFC回收率影響效應的大小依次pH(B)＞上樣濃度(A)＞洗脫濃度(C)＞洗脫速度(D)。經回歸模型擬合，四因子對響應值Y的影響可用以下多元二次方程:

Y=63.31-0.72A-0.83B-0.14C-0.072D-0.71AB-0.053AC-0.7AD-0.41BC+0.54BD-0.21CD-2.500E-0.78A2-0.53B2-2.22C2-0.71D2

表3 響應面曲面方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

2.2.3 兩因素交互影響回收率的響應曲面分析

如圖7所示，回收率的響應面開口向下，回收率Y和4個制約因素呈現明顯的二次拋物線關系。隨著每個因素的增加，響應值回收率Y也在增大。根據吸附動力學理論，隨著pH(B)、上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)、洗脫速度(D)的增加，響應值回收率Y出現極大值，后隨著 A、B、C、D再增加，萃取率 Y呈現不同斜率的下降，該回歸模型具有穩定點，穩定點是最大值。借助Design-Expert Software 8.0中多元二次回歸模型對TFC萃取率進行估算，對二次拋物線函數模型進行極值分析，預測四因素的最佳組合為:上樣濃度0.86 mg/mL，pH=6，洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min此時模型預測極大值Y=87.3667%(P=0.994)。在Z坐標下進行3組重復試驗，TFC回收率平均高達到85.82%，表明該回歸模型能準確預測TFC大孔樹脂吸附性能。

圖7 兩因素交互影響回收率的響應曲面圖分析Fig.7 Response surface analysis of the recovery rate affected by two-factor

3 結論

以茼蒿為原料，對比大孔樹脂分離純化總黃酮的性能，采用單因素和響應面試驗相結合的形式，篩選并優化大孔樹脂的純化工藝條件。經試驗考察5種不同特性的大孔樹脂中，D-101大孔樹脂對TFC的吸附純化顯示出最佳的性能。D-101大孔樹脂分離純化TFC的泄漏點:上樣體積60 mL，飽和點:210 mL。洗脫曲線表明80 mL的95%乙醇溶液可以將黃酮完全洗脫下來。響應面試驗方差分析顯示:上樣pH對TFC回收率影響差異達到顯著水平，而上樣濃度、洗脫濃度和洗脫速度3個因素對TFC回收率影響差異不顯著。通過回歸方程模擬預測最優純化條件組合:上樣濃度0.86 mg/mL，pH=6，洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min，TFC回收率從最初的最高值65.19%提升至87.366%。

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