3種野生漿果果酒中活性物質及抗氧化活性比較*

焦揚，宋海，張勇，高海寧，李彩霞

1(河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖，734000)

2(甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖，7340003)

3(河西學院化學化工學院，甘肅張掖，734000)

自由基是人體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物，過量的自由基會引起細胞的損傷，從而導致多種疾病的發生［1-2］。研究表明，很多天然產物和它們的衍生物具有很好的抗氧化能力，能夠對抗或減緩氧自由基對機體造成的影響［3-4］。許多藥食兩用植物是活性氧清除的潛在來源，具有很好的抗氧化活性和自由基清除能力［5-6］。

白刺(Nitraria tangutorum Bobr)是蒺藜科白刺屬植物，是我國西北地區特有的一種野生植物資源［7］。白刺果中營養成分和藥用保健活性成分種類多，具有調經活血，消食健脾，降血脂、抗氧化、降血糖、免疫調節、抗疲勞和耐寒冷、保護化學性肝損傷、延緩衰老等方面的作用［8］。沙棘(Hippophae rhamnoides Linn)是胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，沙棘果富含各種維生素、氨基酸、微量元素、黃酮等物質，具有極高的營養保健價值［9］。現代醫學研究證實，沙棘果具有抗衰老、清除自由基、抗輻射、提高免疫力、抗腫瘤等作用［10］。黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)屬茄科枸杞屬，為我國西部特有的沙漠藥用植物。黑果枸杞果實可用于治療心熱病、心臟病、月經不調、停經等病癥［11］。

現有研究主要涉及到3種漿果的活性成分和藥理作用，在加工等方面也有報道［12-13］，但對于3種漿果果酒的活性成分及其抗氧化能力的系統研究未見報道。本工作考察了3種野生漿果果酒總黃酮、多酚、多糖、花色苷和原花青素的含量，并采用不同自由基的清除體系及對鐵離子的還原能力和脂質過氧化表征了果酒的抗氧化活性，并與梅鹿輒干紅葡萄酒做比較，以期為新型保健酒的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白刺、沙棘、黑果枸杞漿果采自張掖市以東10 km左右的荒灘上，漿果成熟采摘后，以鮮果與水質量比為1∶3直接打漿，按干紅酒工藝發酵［14］，原酒于4℃冰箱陳釀1個月后待測;梅鹿輒葡萄采自張掖地區高臺縣某釀酒葡萄種植園，成熟后采摘，按干紅葡萄酒工藝發酵，原酒于次年3月份倒罐后取樣測定。

1.1.2 試劑

蘆丁(國藥集團化學制劑有限責任公司);1，1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)、2，2-聯氮-雙-3-2 基苯丙噻吡咯啉-6-磺酸(ABTS)、2，4，6-三(2'-吡啶基)-1，3，5-三嗪(TPTZ)，均購自Sigma公司;過硫酸鉀、乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、水楊酸、沒食子酸、兒茶素、香草醛、甲醇等均為國產分析純。

1.1.3 儀器

數顯恒溫水浴鍋(HH-4)，國華電器有限公司;分析電子天平(FA2104)，Mettler Toledo公司;S24分光光度計，上海棱光技術有限公司;KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;CRG21Ⅱ高速冷凍離心機，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮含量的測定

［15］。根據回歸方程 y=1.025 8x+0.004，R2=0.999 8，其中 y代表吸光度，x代表蘆丁含量，mg，計算總黃酮含量。

1.2.2 多酚含量的測定

參照文獻［16］。根據回歸方程 y=0.005 7x-0.004，R2=0.996 2，其中 y代表吸光度，x代表多酚含量，μg，計算總酚含量。

1.2.3 多糖含量的測定

參照文獻［17］稍有修改。準確吸取0.2～0.5 mL酒樣，分別置于試管中，用蒸餾水補至2 mL，加入1 mL的6%苯酚，再加入5 mL的濃H2SO4，沸水浴30 min，冷卻至室溫。以試劑空白為參比，在波長490 nm處測定吸光度，根據回歸方程y=0.006 4x+0.020 1，R2=0.998 1，y代表吸光度，x代表葡聚糖含量，mg，計算多糖的含量。

1.2.4 原花青素含量的測定

參照文獻［18］稍有修改。準確吸取1.0 mL酒樣，分別加入6.0 mL 3%香草醛-甲醇溶液及3.0 mL濃HCl，混合均勻后，在 20℃水浴中反應 15 min，500 nm波長下測定吸光度值。根據回歸方程y=0.059 2x，R2=0.999 3，y代表吸光度，x代表原花青素含量，mg，計算原花青素的含量。

1.2.5 果酒中花色苷含量的測定

采用pH示差法［19］。取待測樣品0.2 mL分別用pH1.0(0.2 mol/L KCl緩沖液)和 pH 4.5(0.2 mol/L NaAC緩沖液)稀釋，室溫下平衡10 min，分別測定兩樣品在512 nm和700 nm下的吸光度。計算稀釋液吸光值A:

A=(A512-A700)pH1.0-(A512-A700)pH4.5

式中:(A512-A700)pH1.0，樣品在pH 1.0緩沖液中在512 nm和700 nm波長處的吸光值之差;(A512-A700)pH4.5，樣品在pH 4.5緩沖液中在512 nm和700 nm波長處的吸光值之差。

樣品中花色苷濃度計算公式為:

式中:C，待測樣品中花色苷質量濃度，mg/L;MW，樣品中主要花色苷的相對分子質量，MW=449.2;DF，稀釋因子;E，樣品中主要花色苷的摩爾吸收率，ε=26 900;L，比色杯的寬度。

1.2.6 果酒對DPPH自由基(DPPH·)的清除作用［20］

式中:A0，不加酒樣的吸光值;Ai，測定液的吸光值;Aj，酒樣的本底吸光值。

1.2.7 果酒對ABTS自由基的清除作用［20］

式中:A0，不加酒樣的吸光值;Ai，測定液的吸光值;Aj，酒樣的本底吸光值。

1.2.8 果酒對羥基自由基(·OH)的清除作用［21］

式中:A0，未加酒樣的測定值;Ai，加酒樣的測定值;Aj，酒樣的本底測定值。

1.2.9 果酒對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用［22］

式中:A0，光照的對照管;Ai，樣品測定管;Aj，酒樣的本底測定值。

1.2.10 果酒對鐵離子的還原力

按文獻［23］稍有修改。取酒樣0.1 mL，加入TPTZ工作液0.9 mL，然后用緩沖液稀釋至10 mL，于35℃水浴中反應30 min后，測定其在596 nm處的吸光值。以FeSO4(濃度為0.2～1.6 mmol/L)作標準曲線，FRAP值還原能力以單位質量樣品相當于FeSO4的還原能力的毫摩爾數來表示。

1.2.11 果酒脂質過氧化的測定

采用硫氰酸銨比色法［24］，過氧化抑制率的計算如下:

式中:Ai，樣品的吸光值;A0，對照的吸光值。

1.3 數據處理

采用SPSS11.5和Origin8.0軟件進行數據分析和做圖。所有樣品均平行測定3次，測定結果以x±s表示;相關性分析采用相關系數法，顯著性界值為P＜0.05，極顯著界值為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 三種野生漿果酒與干紅葡萄酒活性成分的比較

如表1所示，白刺酒、沙棘酒、黒枸杞酒中黃酮、多酚、原花青素均低于干紅葡萄酒，且差異顯著(P＜0.05);沙棘酒中多糖含量最高，與其他3種果酒相比差異顯著(P＜0.05);黒果枸杞酒中原花青素含量最低，與其他3種果酒相比差異顯著(P＜0.05)，但其花色苷的含量是最高的，與其他3種果酒的差異也是顯著的(P＜0.05)。

表1 野生漿果果酒與干紅葡萄酒的活性成分比較Table 1 Wild berry fruit wine and red wine active ingredients

2.2 野生漿果酒抗氧化活性比較

2.2.1 野生漿果酒對DPPH·的清除效果

如圖1所示，黒果枸杞酒對DPPH·的清除率最大，為97.14%，且與白刺酒和沙棘酒相比差異顯著(P＜0.05)，但與干紅葡萄酒對DPPH·的清除率相比差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同酒對DPPH·的清除作用Fig.1 Scavenging effect of different fruit wine on DPPH radical

2.2.2 野生漿果果酒與干紅葡萄酒對ABTS自由基的清除效果

ABTS自由基目前已被廣泛應用于生物樣品的總氧化能力的測定［25］。如圖2所示，白刺酒、沙棘酒和和黑枸杞酒對ABTS自由基的清除率均較干紅葡萄酒小，且差異顯著(P＜0.05);沙棘酒與黑果枸杞酒相比較對ABTS自由基的清除率差異不顯著(P＞0.05);白刺酒對ABTS自由基的清除率是最低的。

圖2 不同酒對ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of different fruit wine on ABTS radical

2.2.3 野生漿果酒對·OH的清除效果

·OH可以造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化損傷，使細胞壞死或突變，還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關。如圖3所示，沙棘酒對·OH的清除率最大，為97.98%，與白刺酒相比差異不顯著(P＞0.05)，但與黑枸杞酒和干紅葡萄酒對·OH的清除率的差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同酒對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of different fruit wine on hydroxyl radical

2.2.4 野生漿果酒對O2-·的清除效果

在易氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O2-·，它可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560 nm處有最大吸收，而抗氧化物質可清除O2-·從而抑制甲腙的形成。光還原反應后，反應液藍色愈深，說明清除能力愈低，反之愈高。如圖4所示，白刺酒對O2-·的清除率最大，為90.93%，與其他3種果酒相比較差異顯著(P＜0.05);沙棘酒與黑果枸杞酒對O2-·清除率相比差異不顯著(P＞0.05);干紅葡萄酒對O2-·的清除率是最低的。

圖4 不同酒對O2-·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of different fruit wine on superoxygen anion radical

2.2.5 野生漿果酒對鐵離子的還原力及對亞油酸的抑制作用

Fe3+-TPTZ可被樣品中抗氧化物質還原為二價鐵形式，溶液呈現出藍色，并在波長593 nm處具有最大光吸收，根據吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強弱。FRAP值越大，表明由抗氧化物質還原的Fe2+越多，即抗氧化物質的抗氧化活性越強。如圖5所示，黑果枸杞酒對Fe2+還原能力最強，為11.29 mmol/L，但其與沙棘酒及干紅葡萄酒的差異不顯著(P＞0.05)，但與白刺酒對Fe2+還原能力差異顯著(P＜0.05)。由圖6可見，白刺酒對亞油酸氧化的抑制效果是最弱的，其次為沙棘酒和黑枸杞酒，對亞油酸氧化的抑制效果最好的為干紅葡萄酒。

2.3 野生漿果果酒中活性成分含量與抗氧化活性的相關性分析

圖5 不同酒的還原力Fig.5 The determination of reducing power different wine

圖6 不同酒對亞油酸的抑制作用Fig.6 Inbibition effect of different fruit wine on linoleie acid

采用SSPS11.5軟件對干紅葡萄酒及3種野生漿果果酒中多糖、花色苷、黃酮、多酚、原花青素與對DPPH·、ABTS自由基、·OH、O2-·的清除率和對Fe2+還原力及亞油酸的抑制率的相關系數進行顯著性差異分析，結果如表2所示。

表2 活性物質含量與抗氧活性的相關性Table 2 Correlation between active components and antioxidant activity of different fruit wine

由表2可見，果酒中多糖含量與DPPH·的清除率呈負相關，與·OH的清除能力呈正相關(P＜0.05)，但與其他表征指標之間無相關性;花色苷含量與DPPH·的清除率呈正相關，與·OH的清除率呈負相關(P＜0.01);黃酮、多酚、原花青素與ABTS自由基的清除能力均呈正相關，且差異極顯著(P＜0.01)，均與O2-·清除率呈負相關(P＜0.05)，而黃酮、多酚還與亞油酸的抑制率呈正相關，差異為顯著(P ＜0.05)。

3 分析與討論

抗氧化活性的研究目前分為體內和體外實驗兩類，體外實驗由于作用機理不同，抗氧化劑在不同體系或介質中顯示出不同的抗氧化或促氧化作用，由此對一種抗氧化劑的評估與實驗體系緊密相關，單一的體系較難全面體現其生物學意義［6］。

對野生漿果果酒中活性成分含量與抗氧化能力進行相關性分析可見，對·OH的清除率與果酒中多糖和花色苷的含量有關。陳留勇等從黃桃果肉中分離出2種水溶性多糖HTP1和 HTP2，發現2種多糖對·OH有很好的清除效果，但HTP2多糖對O2-·無任何清除作用［25］。本研究中多糖濃度與·OH清除率正相關但與O2-·清除率不相關。可能的原因是由于多糖結構比蛋白質和核酸的更為復雜，可分為一級、二級、三級和四級結構，糖鏈的組成形式及糖基結構都會影響到多糖的性質;果酒中黃酮、多酚和原花青素含量與ABTS自由基的清除率呈正相關，而與O2-·的清除率呈負相關，且對亞油酸過氧化的抑制率與黃酮和多酚呈顯著性正相關;對DPPH·的清除率與果酒中花色苷的含量呈正相關。張靖媛等認為南瓜酒對DPPH·、·OH、O2-·的清除效果與總多酚和多糖含量之間存在顯著的相關性(P＜0.05)［26］。因此，花色苷、黃酮、多酚以及原花青素這些多酚類物質對ABTS自由基的清除率、抑制亞油酸過氧化的抑制率、·OH和O2-·的清除率有不同程度的差異。可能的原因是發酵中漿果中酚類物質可形成解離和聚合的復雜反應，且這些反應與溫度、時間、浸漬效果等多種因素有關［14］，因此使不同野生漿果的多酚類物質對所表征自由基產生了不同的清除效果。所有的活性物質含量與Fe2+的還原能力均無顯著性關系。可能的原因是果酒使Fe3+轉化為Fe2+是各種活性成分共同作用的結果，由此與某一單一活性成分的相關性表現不顯著。

4 結論

3種野生漿果果酒及干紅葡萄酒對考察的自由基均有不同程度的清除效果，其中沙棘酒對·OH的清除率最高為97.98%;黒果枸杞酒對DPPH·的清除率和鐵離子的還原能力最高，分別為97.14%和11.29 mmol/L;白刺酒對 O2-·的清除率最高為90.93%;對野生漿果果酒中活性成分含量與抗氧化能力進行相關性分析可見，對·OH的清除作用與果酒中多糖和花色苷的含量有關;果酒中黃酮、多酚和原花青素含量與ABTS自由基的清除率呈正相關，而與O2-·的清除率呈負相關，且對亞油酸過氧化的抑制率與黃酮和多酚呈顯著性正相關，相關系數均在0.669～0.900;對DPPH·的清除與果酒中花色苷的含量呈正相關;但所有的活性物質含量與Fe2+的還原能力均無顯著性關系。

參考文獻

［1］ GENG mingjiang，REN mingxin，LIU Zhenling，et al.Free radical scavenging activities of pigment extract from Hibiscus syriacus L.petals in vitro［J］.African Journal of Biotechnology，2014，11(2):429-435.

［2］ Halliwell B.The wanderings of free radical［J］.Free Radical Biology and Medicine，2009，46(5):531-542.

［3］Marija M Radojkovic′，Zoran P Zekovic′，Senka S Vidovic′，et al.Free radical scavenging activity and total phenolic and flavonoid contents of mulberry(Morus spp.L.，Moraceae)extracts［J］.Hemijska Industrija，2012，66(4):547-552.

［4］ 段琦梅，梁宗鎖.黃芪和黨參提取物的抗氧化活性研究［J］.西北植物學報，2010，30(10):2 123-2 127.

［5］ CHEN Fu-an，WU An-bang，CHEN Chou-yang.The influence of different treatments on the free radical scavenging activity of burdock and variations of its active components［J］.Food Chemistry，2004，86(4):479-484.

［6］ 顧海峰，李春美，徐玉娟，等.柿子單寧的制備及其抗氧化活性研究［J］.農業工程學報，2007，23(5):241-245.

［8］ 胡娜，素有瑞，韓麗娟，等.不同顏色果實唐古特白刺葉中礦物質元素含量的比較［J］.分析測試技術與儀器，2013，19(3):129-132.

［9］ 楊文繼，閆朝壘，林增祥，等.我國沙棘化學成分及其功能開發研究進展［J］.新疆中醫藥，2008，26(5):67-70.

［10］ 宓偉，鞠艷華.沙棘對小鼠免疫功能作用的研究［J］.亞太傳統醫藥，2009，5(1):38-39.

［11］ 李彩霞，焦揚，梁倩倩，等.黑果枸杞提取物抗氧化性研究［J］.食品工業科技，2006，27(10):55-57.

［12］ 牛廣財，朱丹，王軍，等.沙棘酒清除自由基作用的研究［J］.中國食品學報，2010，10(1):36-41

［13］ 陳海魁，劉雅琴.黑果枸杞果醋發酵工藝研究［J］.安徽農業科學，2009，37(32):16 126-16 127

［14］ 李華.葡萄酒工藝學［M］.北京:科學出版社，2010.

［15］ 蔣益虹.荷葉黃酮的乙醇提取工藝優化研究［J］.農業工程學報，2004，20(4):168-171.

［16］ 劉洋.蒙古櫟葉片多酚的超聲提取優化及抗氧化能力［J］.東北林業大學學報，2010，38(1):70-73.

［17］ 趙寧，問亞琴，潘秋紅.苯酚-硫酸法測定干紅葡萄酒中的多糖含量［J］.中外葡萄與葡萄酒，2011，5(3):9-12;17.

［18］ 郭慶啟，張娜，李夢云，等.落葉松松塔多酚成分和抗氧化能力與海拔的相關性研究［J］.北京林業大學學報，2012，35(1):59-63.

［19］ 孫婧超，劉玉田.pH示差法測定藍莓酒中花色苷條件的優化［J］.中國釀造，2011，5(11):171-173.

［20］ 范金波，蔡茜彤，馮敘橋，等.5種天然多酚類化合物抗氧化活性的比較［J］.食品與發酵工業，2014，40(7):77-83.

［21］ 高海寧，李彩霞，張勇，等.“黑美人”土豆色素體外抗氧化性研究［J］.天然產物研究與開發，2012，24(2):224-228，233.

［22］ 王學奎.植物生理生化實驗原理和技術［M］.北京:高等教育出版社，2006:172-173.

［23］ 劉琴，李敏，胡秋輝.黑米麩皮與紫包菜花青素提取物的組成、抗氧化性與穩定性比較研究［J］.食品科學，2012，33(19):113-118.

［24］ 張京芳，王冬梅，張強.香椿葉抗脂質過氧化物的分離及抗氧化特性［J］.農業工程學報，2009，25(1):285-290.

［25］ 陳留勇，孟憲軍，賈薇，等.黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究［J］.食品科學，2004，25(1):167-170.

［26］ 鄭善元，陳填烽，鄭文杰.茶水提物清除DPPH和ABTS自由基的光譜學研究［J］.光譜學與光譜分析，2010，30(9):2 417-2 423.