雞軟骨中硫酸軟骨素的分離純化*

王鑫，徐麗萍，宋志鵬

(哈爾濱商業大學食品工程學院，省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150076)

雞軟骨中的硫酸軟骨素(簡稱CS)作為結締組織天然存在的重要成分，發揮著許多生理功能。比如CS可以和膠原蛋白結合成高分子材料而起到使各器官特定結構固定的作用［1］。雖然CS的主鏈結構并不復雜，但就硫酸基、硫酸化程度和2種差異向異構糖醛酸鏈內的分布呈現了高度的不均一性。CS的精細結構決定著其與多種蛋白質分子的相互作用以及功能的特異性［2］。因此，作為動物軟骨中特有的糖胺聚糖，CS還具有調節關節機能、防治動脈硬化、抗凝血、清除自由基、增強免疫、抗病毒、調節動物體內水分和抗腫瘤等多種生理功能［3］。從雞軟骨中提取的CS中，除含有酸性黏多糖外，還含有很多水溶性物質，而這些物質的存在則會降低提取物中CS的含量，降低CS的生理活性，因此實驗過程中必須將這些雜質除去，以提高CS的純度［4］。

離子交換樹脂是一種具有網狀結構且含有離子活性基團而且能與溶液中的其他物質進行交換或吸附的聚合物，利用它與流動相中的離子可以進行可逆的交換這一性質來對離子型化合物進行純化。由于化合物所帶電荷性質和數量的不同，進而與樹脂的交換或吸附能力也不同，利用該性質可對雞軟骨中的CS進行分離純化［5-6］。凝膠層析法又稱排阻層析、分子篩過濾等。它的優點是層析所用的凝膠是1種具有三維空間的多孔網狀結構，且呈珠狀顆粒的惰性載體，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，像篩子一樣，直徑大于孔徑的分子將無法進入凝膠內部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣泛的溫度范圍下進行，無需有機溶劑，設備簡單，操作方便，并且保持所分離成分的生物學活性，對于高分子物質有很好的純化效果［7］。采用離子交換樹脂法對CS粗提物進行純化工藝的研究，為獲得純度較高的CS，將進一步采用凝膠層析對其進行純化，以期得到更好的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸軟骨素粗提物，實驗室自制;硫酸軟骨素標準品，美國Sigma公司;732陽離子交換樹脂，杭州爭光化工廠;D218陰離子交換樹脂，西安藍曉科技新材料有限公司;201*7型樹脂，沈陽市新西試劑廠;葡聚糖凝膠G-75，上海君威生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中硫酸軟骨素

稱取5份3 g原料，分別置于燒杯中，按料液比1∶6(g:mL)加入質量分數為4%的NaOH溶液，將燒杯置于超聲波儀器中，在100 W的功率下超聲處理100 min，調節pH值為6.8。按13∶10 000(g:mL)的酶質量和溶液體積比加入木瓜蛋白酶(酶活力80萬U/g)，在45℃恒溫水浴中加熱1h，然后將燒杯迅速放入90℃水浴箱中并保溫20 min進行滅酶，用HCl調節pH值至5.9。按13∶10 000(g:mL)的酶質量和溶液體積比加入胃蛋白酶(酶活力3 000 U/g)，分別在48℃恒溫水浴加熱103 min。迅速升溫到90℃保溫20 min滅酶。調節pH值至6.8～7.2內，按溶液總體積的3%加入NaCl，攪拌均勻后加入無水乙醇，使乙醇濃度達到70%，靜置12h，吸出上清液后收集沉淀進行離心，在用乙醇對沉淀進行1～2次的洗滌，置于55～60℃干燥箱中干燥、粉碎后即得成品，稱量，計算 CS 的得率［8］。

1.2.2 離子交換樹脂純化硫酸軟骨素

1.2.2.1 D218離子交換樹脂的預處理

用去離子水浸泡離子交換樹脂數小時后進行過濾，然后用體積分數85%乙醇浸泡3h后用去離子水洗凈。采用2倍樹脂體積、濃度為70mg/mL的HCl溶液浸泡3h，再用去離子水洗至中性，然后濾干。再采用2倍樹脂體積、濃度為80mg/mL的NaOH溶液浸泡3h，用大量去離子水洗至中性，最后用去離子水浸泡備用。

1.2.2.2 D218離子交換樹脂純化硫酸軟骨素工藝條件的選擇

將D218陰離子交換樹脂采用濕法裝柱后，分別用 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的樹脂與 CS 粗提物水溶液體積比進行動態吸附實驗，分別吸附30、40、50、60、70 min 后，將 CS 粗提物水溶液以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速分別經過玻璃樹脂柱，采用樹脂與NaCl溶液體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的比例，分別用濃度為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mol/L 的NaCl溶液對已經飽和的樹脂進行洗脫，每隔15 min收集一次洗脫液，共收集8次，分別測定每一次的CS含量，確定最佳解吸時間。測定流出液中CS的含量，并計算其吸附率，選出樹脂純化最佳條件［9］。

1.2.3 凝膠層析法純化硫酸軟骨素

1.2.3.1 葡聚糖凝膠G-75的預處理

取18g葡聚糖凝膠G-75粉末，浸泡于300 mL蒸餾水中使其充分溶脹(室溫，24 h)，然后經過反復傾斜除去表面的懸浮顆粒，將葡聚糖凝膠G-75浸泡過夜備用。

1.2.3.2 凝葡聚糖凝膠G-75純化硫酸軟骨素步驟

將凝膠裝柱、上樣和平衡后，采用pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉溶液進行洗脫，將CS粗純物水溶液以0.7 mL/min的流速經過凝膠，采用自動部分收集器對流出液進行收集，共接50支管，每管接約2.5 mL。

1.2.3.3 硫酸軟骨素純化物制備

通過離子交換樹脂和凝膠層析法最佳工藝條件純化CS，經干燥濃縮后即得CS純化物，并計算CS的純度:

式中:W，CS純度，%;m，純化物中CS的質量，g;m1，純化物的質量，g。

1.2.4 硫酸軟骨素HPLC分析

色譜柱:Ultimate XB-NH2柱(25 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:232 nm;流動相:醋酸鈉緩沖溶液(pH 5.6)-乙腈(體積比95∶5);進樣量10 μL;流速:1.0 mL/min。比較CS標準品與樣品圖譜出峰位置和保留時間。

2 結果與討論

2.1 超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中CS

以CS得率為指標，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中CS，結果見表1。

表1 超聲波輔助堿-雙酶法提取CSTable 1 Ultrasonic-assisted extraction CS with alkali-double enzymatic

由表1可知，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取CS得率最高，為26.85%。采用雙酶法進行2次酶解可以充分水解CS中的蛋白質，而且水解過程中既不會使CS發生水解也不會產生水解黏多糖的酶。同時，還可從提取CS的廢液中回收蛋白，既解決了環境污染問題，還可以確保回收的蛋白質的品質和風味。

2.2 離子交換樹脂法純化硫酸軟骨素實驗結果分析

2.2.1 硫酸軟骨素純化最佳上樣量的確定

圖1 上樣量的選擇Fig.1 The optimum choice of the sample volume

由圖1所示，隨著CS粗提液用量和樹脂體積比的不斷加大，CS的吸附率呈整體下降趨勢。在二者體積比為1∶1時，吸附率為最大值，此時樹脂可能已經處于飽和狀態，如果繼續增大上樣量，就會造成部分CS成分的損失。而如果上樣量過少，就會使純化時間變長，因此針對吸附效果以及經濟因素方面的考慮，確定CS粗提液用量與樹脂體積比為1∶1為最佳上樣量。

2.2.2 硫酸軟骨素純化最佳吸附時間的確定

如圖2所示，吸附時間在30～70 min時曲線呈上升趨勢，吸附率在60 min吸附時間處取得最大值，當吸附時間超過60 min后吸附率反開始下降。這可能是由于吸附是以物理過程為主伴隨這化學吸附，如果時間過長，就會破壞樹脂達到的平衡，故確定60 min為最佳吸附時間。

圖2 最佳吸附時間的選擇Fig.2 The optimum choice of the adsorption time

2.2.3 硫酸軟骨素純化流速的確定

如圖3所示，CS吸附率取得最大值是在吸附流速為0.5 mL/min時，而當吸附流速超過1.0 mL/min時，吸附率呈逐漸下降的趨勢。其原因是較快的流速不利于吸附的進行，但流速過慢又會使純化時間延長，增加生產成本。而CS的吸附率在0.5和1.0 mL/min的流速中差異不大，所以從經濟成本的角度考慮吸附流速應以1.0mL/min為宜。

圖3 流速的選擇Fig.3 The optimum choice of the flow rate

2.2.4 硫酸軟骨素純化洗脫劑NaCl濃度的確定

如圖4所示，當NaCl溶液濃度為1.5～3.5 mol/L時，洗脫液中CS含量呈上升趨勢，當NaCl溶液濃度3.0 mol/L時CS的解吸率最大，當NaCl溶液濃度繼續增大時呈下降趨勢，這是由于隨著NaCI濃度的不斷增大，其它某些雜質也會隨CS一起沉淀出來，從而使CS的純度降低。因此確定CS純化最佳洗脫濃度為3.0 mol/L。

圖4 洗脫液濃度的選擇Fig.4 The optimum choice of the concentration of the eluant

2.2.5 硫酸軟骨素純化洗脫劑NaCl用量的確定

如圖5所示，當洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂體積比在1∶1～5∶1時，解吸率呈逐漸上升的趨勢。當洗脫劑NaCl溶液的用量與樹脂體積比為5∶1時，CS的解析率達到最大值;但是繼續加大洗脫液用量時解吸率反而降低，可能是因為隨洗脫液體積增大溶液中的CS的質量濃度減小，從而影響了CS溶液的洗脫效果，因此應確定5∶1為CS純化洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂用量的最佳體積比。

圖5 NaCl用量的選擇Fig.5 The optimum choice of the NaCl amount

2.2.6 硫酸軟骨素純化解吸時間的確定

如圖6所示，CS的解吸率隨解吸時間的延長而增大。在解析時間為75 min時，CS的解吸達到最大值，繼續增加解吸時間，曲線則呈下降趨勢且趨于穩定，這說明時樹脂中的CS在解吸75 min時已基本解吸完全，故確定75 min為最佳解吸時間。

圖6 最佳解吸時間的選擇Fig.6 The optimum choice of the desorption time

2.3 葡聚糖凝膠G-75洗脫硫酸軟骨素結果與分析

從圖7中可以看出，采用流速為0.7 mL/min的的乙酸-乙酸鈉溶液(pH=4.8)洗脫時，隨著管數的推進，吸光值逐漸增加，在第30管出現最大吸光值為0.785，之后隨著管數的推進，吸光值逐漸減小，在第42管出現零值，之后全部為零趨于穩定。由此可見，第30管CS含量最高，第42管之后幾乎不含有CS。

圖7 CS洗脫結果Fig.7 The elution result of CS

2.4 離子交換樹脂法制備硫酸軟骨素純化物

采用離子交換樹脂D218純化CS的最佳工藝條件為:CS粗提物溶液體積與樹脂體積比為1∶1，吸附流速為1.0 mL/min，吸附時間為60 min，洗脫劑為3.0 mol/L的NaCl溶液，最佳解析時間為75 min，洗脫劑用量與樹脂體積比為5∶1，再采用葡聚糖凝膠G75純化CS，純化后CS純化物的純度見表2。

表2 CS純化物的純度表Table 2 The purity result of purified product of CS

如表2所示，離子交換樹脂法純化后的CS純度為72.03%，葡聚糖凝膠G-75純化后CS純化物的純度提高至99.30%。

2.5 HPLC檢測結果與分析

由圖8、圖9可以看出，CS標準品和純化后的CS樣品有相同的出峰位置，峰形較好，保留時間比較短，且均在17.5～18.5 min內，進一步證明了提取于雞軟骨中并經過純化后得到的物質為CS。

圖8 CS標準品HPLC檢測圖譜Fig.8 HPLC chromatograms of CS standard

圖9 CS純品HPLC檢測圖譜Fig.9 HPLC chromatograms of CS sample

3 結論

采用離子交換樹脂法及凝膠層析法對超聲波輔助堿-雙酶法提取的CS進行純化并對純化工藝進行了優化，并對純化后得到的物質進行了定性定量分析。通過靜態吸附及解吸實驗的篩選，確定CS的最佳純化樹脂為D218型陰離子交換樹脂。離子交換樹脂法純化CS的最佳工藝條件為:吸附液用量與樹脂體積比為1∶1吸附流速為1.0 mL/min;吸附時間為60 min;洗脫劑NaCl溶液的濃度為3.0 mol/L;洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂體積比為5∶1;最佳解析時間為75 min。純化后CS純度為72.03%。采用凝膠層析法純化CS，純化后CS純度為99.30%。通過高效液相色譜法對純化后的物質進行檢測，結果表明純化后得到的物質與CS標準品出峰位置以及結構都一致，進一步證明從雞軟骨中提取的物質為CS。

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