采用ATP生物發光法分析6株常見細菌ATP含量差異

田雨，侯玉柱，柯潤輝，尹建軍，宋全厚

(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

ATP生物發光法是新近發展起來的一種微生物快速檢測技術［1］，具有快速、簡單、經濟的特點［2］，目前主要應用在食品生產企業的日常衛生管控方面［3-4］，它與涂抹法結合可快速測定食品生產加工環節各個衛生關鍵控制點的衛生狀況［5-6］，快速評估，及時發現問題，降低微生物污染發生的可能性［7-8］。

由于ATP生物發光法無法定性鑒別細菌種類［9-12］，因此不同細菌 ATP 含量是否一致［13-14］，對該方法的檢測結果影響較大。鑒于此，本研究以ATP生物發光法為基礎，輔以GB4789.2-2010方法，選擇大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6種常見細菌，分析和對比不同常見細菌中ATP含量的差異性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234);枯草芽孢桿菌(CICC10275);蠟狀芽孢桿菌(CICC20511);乳酸鏈球菌(CICC20711);乳酸片球菌(CICC20719)。

1.1.2 儀器與試劑

ATP熒光檢測儀(SF0012型)，購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養箱;渦旋振蕩器;高壓滅菌鍋。

ATP標準品(三磷酸腺苷二鈉鹽);復合熒光試劑(產品編號ZF0011)，購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;平板計數瓊脂培養基(PCA);無菌生理鹽水;無菌水。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立6株細菌的菌落總數(CFU/mL)與ATP熒光值(RLU/50μL)的數學模型

自冷藏的斜面培養基中挑取6株細菌——大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)，分別劃線接種于培養皿中，36℃培養24 h。將10 mL無菌生理鹽水注入已劃線培養24 h的平皿培養基表面，打散其上的菌落并收集于無菌玻璃試管中，振蕩搖勻，作為菌懸液原液。吸取每株細菌的菌懸液原液各1 mL放入無菌玻璃試管中，加4 mL生理鹽水混合均勻，配制成稀釋度為10-1的6株細菌的混合液。以無菌生理鹽水10倍梯度稀釋各細菌的菌懸液原液及其混合液，配制成10-1～10-8梯度稀釋菌液。吸取 10-6、10-7、10-8梯度稀釋菌液各 1 mL，按照GB4789.2-2010測定其菌落總數。再吸取各菌株及其混合菌液的梯度稀釋液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復合熒光試劑，放入ATP熒光檢測儀中測定其熒光值。以菌液的菌落總數(CFU/mL)及ATP熒光值(RLU/50μL)建立數學模型。

1.2.2 建立ATP標準溶液濃度與其熒光值的數學模型

稱取ATP標準品0.055 1 g，以無菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-6mol/mL的ATP基礎溶液。吸取ATP基礎溶液1 mL，以無菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液。對10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液進行10倍梯度稀釋，配制濃度為10-9～10-13mol/mL的ATP標準系列溶液。吸取ATP標準系列溶液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復合熒光試劑，以微量熒光檢測儀測定其熒光值。根據ATP標準系列溶液的濃度(mol/mL)與相應的熒光值(RLU/50μL)，建立數學模型。

2 結果與分析

2.1 各細菌的ATP熒光值(RLU/50μL)與菌落總數(CFU/mL)的關系

分別測定大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)等6株細菌的ATP熒光值和菌落總數，由于每次可測得5～6對數據，為獲得統計學中的大樣本數量(n≥30)，多次重復測定，保證每株細菌測得30對或30對以上的數據用于建立數學模型。表1內是6株細菌及其混合菌液的菌落總數對數值［log10(CFU/mL)］與ATP熒光值對數值［log10(RLU)］的數學模型，由表1的數學模型，可計算出6株細菌在相同熒光值下對應的菌落總數，見表2。

表1 六株細菌的菌落總數與ATP熒光值的數學模型Table 1 Mathematical models between aerobic plate count and ATP fluorescence value of six strains

表2 六株細菌及其混合物在不同ATP熒光值下的菌落總數CFU/mLTable 2 Aerobic plate counts of six strains and their mixture with different ATP fluorescence values CFU/mL

由表2可知，當熒光值為100時，6株細菌及其混合物的菌落總數基本維持在104CFU/mL左右，并且隨著熒光值的10倍遞增，菌落總數也呈現10倍遞增趨勢，當熒光值達到1 000 000(儀器的最大量程為7位數)時，菌落總數始終保持在108CFU/mL的水平。因此，當熒光值相同時，無論是單一純菌樣品還是含有多種混合細菌的樣品，其菌落總數都保持在相同或相近的數量級上。

為了進一步確認在ATP熒光值均相同的情況下，6株細菌及其混合菌液的菌落總數是否存在明顯差異，對表2中6株細菌的菌落總數進行無重復的雙因素方差分析，結果見表3。

由表 3可知，F行=8.13＞F行crit=2.87，P=4.62×10-4＜0.05，表示當 ATP熒光值(在100～1 000 000RLU/50 μL范圍內)數量級不同時，實驗所用的6株細菌的菌落總數有明顯差異。即ATP熒光值的數量級對各細菌的菌落總數有顯著影響。而F列=1.31＜F列crit=2.71，P=0.30＞0.05，表示當 ATP熒光值(在100～1 000 000 RLU/50μL范圍內)相同時，各細菌的菌落總數無顯著差異。即細菌的種類雖然會導致ATP生物發光法所測得的菌落總數各不相同，但差異并不明顯，不會對菌落總數的報告結果產生顯著影響。

表3 六株細菌在相同熒光值下的菌落總數的無重復雙因素方差分析CFU/mLTable 3 No repeat two-way ANOVA of aerobic plate counts of six strains and their mixture with same ATP fluorescence value CFU/mL

2.2 ATP濃度與熒光值的關系

表4 ATP標準溶液濃度與相應的熒光值Table 4 Concentration of ATP standard solution and their fluorescence value

根據ATP濃度的對數值和熒光值的對數值建立數學模型，如圖1。

圖1 ATP標準溶液濃度與其相應熒光值的數學模型Fig.1 A mathematical model between concentration of ATP standard solution and their fluorescence values

可知ATP含量與其熒光值的相關數學模型為:

Y=0.968 5X+15.443 4

其中，Y為ATP熒光值的對數值［log10(RLU)］;X為ATP標準溶液濃度的對數值［log10(mol/mL)］;二者相關系數(R2)為0.994 3，數學模型線性良好。

2.3 各細菌的菌落總數與ATP濃度的關系

將ATP濃度與熒光值的數學模型Y=0.968 5X+15.443 4(見圖1)代入表1中的6株菌落總數與熒光值的數學模型，可推導出株菌落總數對數與ATP濃度對數值的數學模型，見表5。

表5 六株細菌的菌落總數與ATP含量的數學模型Table 5 Mathematical models between aerobic plate count and ATP content

根據表5中的數學模型，可計算不同菌落總數水平下的各細菌ATP含量(mol)。但由于受本研究所使用的ATP熒光檢測儀量程所限(見表2)，僅選取104～108CFU/mL(與ATP熒光檢測儀100～1 000 000 RLU的量程相對應)共5個數量級的菌落總數，代入表5的數學模型進行計算。

表6 六株細菌在不同菌落總數下的ATP含量Table 6 ATP contents of six strains with different aerobic plate counts

由表6可知，6株細菌的ATP含量均隨菌落總數的10倍增長而逐級提高，當菌落總數為104CFU/mL時，6種細菌的ATP總量基本都在10-14mol/mL的水平。當菌落總數為108CFU/mL時，6種細菌的ATP總量基本都在10-10mol/mL的水平。雖然大部分細菌的ATP總量并不是絕對嚴格地隨菌落總數的10倍遞增，其兩位有效數字往往有所不同;但當菌落總數相同時，各細菌的ATP含量都在相同或相近的數量級上。

為確定在菌落總數均相同的情況下，6株細菌的ATP總含量是否存在顯著差異，對表6中的數據進行無重復的雙因素方差分析，結果如下:

由表7可知，F行=10.11＞F行crit=2.87，P=1.21×10-5＜0.05，表示當菌落總數的數量級(1～108CFU/mL)不同時，實驗所用的6株株細菌的ATP總含量有明顯的差異。即菌落總數的數量級對各細菌的ATP總含量有顯著影響。而F列=1.24＜F列crit=2.71，P=0.33＞0.05，表示當菌落總數相同時，不同細菌的ATP含量無明顯差異。即細菌的種類不會對ATP生物發光法所測得的各細菌的ATP總含量產生顯著影響。而根據圖1中的數學模型，ATP含量與其熒光值線性相關(R2=0.994 3)，因此雖然6株細菌種屬不同，但當其菌落總數相同時，所測定的ATP熒光值無明顯差異。

表7 六株細菌在不同菌落總數下的ATP含量的無重復因素方差分析mol/LTable 7 No repeat two-way ANOVA of ATP contents of six strains with different aerobic plate counts mol/L

3 結論

目前，對ATP生物發光法的研究，多集中在溫度、pH值、提取劑等外在因素對微生物檢測結果的影響［15-16］，關于不同種類細菌中ATP含量的研究較為稀少［17］。張國龍［18］、張虹妍［19］等為了驗證抗結核藥物的作用，曾以ATP生物發光法測定結核分枝桿菌的ATP含量，但并未橫向比對不同細菌種類之間的差別。本研究分析和比對了大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6株常見細菌的ATP含量，這對ATP生物發光法的實際應用具有重要意義——在使用該方法快速檢測樣品的細菌數量時，可以忽略體積相似或相近的細菌的種屬差異，根據數學模型推算菌落總數，為食品生產加工企業的衛生管控提供快速、準確的技術支撐。

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