復合中藥發酵乳的制備及其體外抗氧化性研究

王景晨，顧瑞霞，曹榮，韓抒

1(南京金陵中等專業學校，江蘇南京，210000)2(揚州大學，江蘇揚州，225127)

中藥作為我國傳統醫學的文化遺產及國寶。中藥中的黃酮、酚以及多糖具有較強的抗氧化活性，具有良好的保健功能，鎮靜催眠作用，抗腫瘤作用，抗炎，降血脂作用，而且其中含有多種益生因子能夠促進乳酸菌及腸道益生菌的生長［1-4］。

研究人員從中藥中選擇了4種藥食同源的中藥——酸棗仁、決明子、枸杞子以及甘草，研究了4味中藥對乳酸菌發酵的影響，優化了復合中藥發酵乳的制備工藝，并對復合中藥發酵乳的體外生物活性進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

酸棗仁、甘草、決明子、枸杞均購于揚州樂購超市;全脂奶粉為新西蘭威士蘭乳業公司產品;白砂糖為廣西風糖生化股份有限公司產品;干乳酪桿菌(實驗室自選分離菌種);DPPH自由基購自Sigma公司;無水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、抗壞血酸、NaCl、FeCl2、FeSO4、水楊酸和EDTA，均為國藥集團化學試劑有限公司產品;菲洛嗪購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 設備

電子天平，上海天平儀器廠;HH-6數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;755S型紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司生產;pHS-3B型精密pH計，上海雷磁儀器廠;康寶電磁爐，國華電器有限公司;SW-CJ-IF型無菌操作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;組織搗碎勻漿機(JJ-2)，中外合資深圳天南海北有限公司;全自動黏度計(RVDV-Π)，美國BrooKfield Engineer in Laboratories，INC;10 速多功能攪拌器，佛山市三水合成塑料五金制品有限公司;微量移液器，Eppendorf公司;XW-80A旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;其余均為常規儀器設備。

1.3 樣品的制備

1.3.1 藥液制備

以酸棗仁為例的藥液煎煮方法:

決明子、枸杞子、甘草藥液制備方法與酸棗仁相同。

1.3.2 中藥發酵乳工藝

奶粉(蛋白質質量12.8%)→40～50℃的水溶解→加熱至60～70℃加糖(6.5%)、加中藥液→均質(20 MPa)→殺菌(95℃，5 min)→接種(3%)→發酵(40℃，3.5 h)→冷藏(4℃)

1.4 感官評定

組織15位具有一定專業知識的人組成評價小組，就發酵乳的感官進行評分。最高分10分，確定加權系數分別為色澤1分，組織狀態3分，香氣2分，滋味4分，最后得分為15位評分員評分的算術平均值。按表1方法對發酵乳進行感官評價，每個樣品做3組平行試驗，將平均值作為最終評價結果［5］。

表1 產品的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation Qandard for product

1.5 中藥發酵乳產品質量的測定

蛋白質、脂肪和微生物指標等按GB 19302-2010 測定［6］。

酸度的測定:取菌種10.0 mL到250 mL的三角燒瓶中，再加入20 mL的蒸餾水和0.5 mL的酚酞溶液，搖勻，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，并在1min內不消失為止。記錄0.1 mol/L的NaOH的溶液所消耗的體積(mL)。

1.6 發酵乳抗氧化活性的測定

用乳酸菌發酵添加復合4味中藥和不添加中藥來研究復合中藥發酵乳的抗氧化活性。

1.6.1 DPPH自由基的清除能力

參照文獻所述方法［7］，將兩種乳酸菌發酵乳系稀釋后，取濾液2.0 mL與2.0 mL體積分數為95%的乙醇混勻，再加入濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL于具塞試管中，搖勻，避光放置30 min后，3 000 r/min下離心10 min，用95%乙醇作參比測定其吸光度Ai。同時測定0.2 mmol/L DPPH溶液與等體積95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測液與等體積95%乙醇混合液在517nm處的吸光度Aj。按公式(1)計算清除率:

式中:Ac，未加待測液時DPPH溶液的吸光度;Ai，加待測液時DPPH溶液的吸光度;Aj，待測液與95%乙醇混合液的吸光度。

1.6.2 羥基自由基(·OH)的清除能力

參照文獻［10］所述方法，將2 mL的6 mmol/L硫酸亞鐵水溶液與2 mL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后，將不同稀釋倍數的發酵乳加入后，再加入2 mL的20 mmol/L的過氧化氫溶液，混勻后在37℃的恒溫水浴中反應1 h時，3 000 r/min下離心10 min，取出冷卻后在510 nm處測定吸光值，每一吸光值平行測定3次，取其平均值。·OH清除率按公式(2)計算:

式中:A0，不含樣品和H2O2;A1，不含樣品，含H2O2;A2，含樣品和 H2O2。

1.6.3 Fe2+螯合能力

參考Deeker［11］的方法并略做改進。取稀釋后的2 mL待測液，加入2 mL 0.01 mmol/L FeCl2·4H2O溶液和2 mL 0.25 mmol/L菲洛嗪，振蕩混勻。反應混合物靜置10 min，在562 nm下測定吸光度，用雙蒸水做空白對照。亞鐵離子鰲合能力用公式(3)表示:

式中:Acontrol，不含樣品;Asample，含樣品。

1.7 數據處理

用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 中藥的添加對干酪乳桿菌發酵特性的影響

2.1.1 酸棗仁浸提液添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的酸棗仁浸提液，默認為1 mL浸提液相當于0.1 g酸棗仁。在4份還原奶中分別加入0，0.5%，1.0%，2.0%的酸棗仁浸提液，然后均質、殺菌、接種量3%、40℃發酵4 h、4℃下冷藏24 h，測定活菌數、酸度、pH值，結果見表2。

從表2中可以看出，添加酸棗仁浸提液對酸度、pH值、活菌數及感官都有很大的影響，對干酪乳桿菌有增菌作用。隨著酸棗仁浸提液添加量的增加，酸度上升，pH值下降，活菌數上升。

表2 酸棗仁浸提液的添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響Table 2 The influence of Semen Ziziphi spinosae on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.2 決明子浸取液添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的決明子浸提液，默認為1 mL浸提液相當于0.1 g決明子。由于決明子浸提液的色澤較深，且味苦澀，對口味的影響很大，故添加量較小。在4份還原奶中分別加入0，0.2%，0.4%，0.6%的決明子，其他工藝條件同2.1.1，測定結果見表3。

表3 決明子浸提液的添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響Table 3 The influence of Semen Cassia on the fermentation properties of Lactobacillus casei

由表3中可以看出，0.4%的決明子添加量效果較好。

2.1.3 枸杞子浸提液添加量對乳酸菌發酵特性的影響

以上述藥液制備方法制備的枸杞子浸提液，默認為1 mL浸提液相當于0.1 g枸杞子。在4份還原奶中分別加入0、0.5%、1.0%、2.0%的枸杞子浸提液，其他工藝條件同2.1.1，測定活菌數、酸度、pH值，結果見表4。

由表4可以看出，枸杞子浸提液對干酪乳桿菌發酵特性的影響比較大，0.5%的添加量效果較好。

2.1.4 甘草浸提液添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響

以上述方法制備的甘草浸提液，默認為1 mL浸提液相當于0.1 g甘草。在4份還原奶中分別加入0，0.5%，1.0%，2.0%的甘草浸提液，其他工藝條件同2.1.1，測定活菌數、酸度、pH值，結果見表5。

表4 枸杞子浸提液的添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響Table 4 The influence of Fructus lycii on the fermentation properties of Lactobacillus casei

表5 甘草浸提液的添加量對干酪乳桿菌發酵特性的影響Table 5 The influence of Radix glycyrrhiza on the fermentation properties of Lactobacillus casei

從表5可以看出，由于甘草味甜，少量的添加對口味的影響不大。但是隨著添加量的增加，酸度、pH值、活菌數以及發酵乳的感官等影響較大。添加量在1%時的感官較好、酸度較高。

2.1.5 復合中藥配比優化

根據單一中藥的試驗結果，按表3～表8中的5種比例添加到還原奶中，其均質壓力為20 MPa、接種量3%干酪乳桿菌、40℃發酵3.5 h、4℃下冷藏24 h，測定活菌數、酸度、pH值，經過重復測定，結果見表6。

表6 復合藥的混合比例Table 6 The mixture ratio of compound herbal

由表7可以看出，②號和⑤號配方與①號相比，酸度升高，pH值下降，活菌數變化不大，可以認為這兩個配方促進干酪乳桿菌產酸;③號和④號配方與①號相比，酸度下降，pH值下降，活菌數下降，可以認為這兩個配方抑制干酪乳桿菌發酵。經感官評價后，一致認為⑤號口味較好，故選⑤號為最終配方。

表7 復合藥比例對干酪乳桿菌發酵特性的影響Table 7 The influence of compound herbal on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.6 復合中藥發酵乳儲藏過程中的指標變化

按⑤號配方制做發酵乳樣品，即酸棗仁2.0%、決明子0.2%、枸杞子0.5%、甘草1.0%、加糖量6.0%，對照組加糖6.5%，其他如均質壓力、殺菌溫度、殺菌時間、接種量、發酵溫度、發酵時間均相同。進行冷藏試驗。實驗結果見圖1、圖2、圖3。

由圖1和圖2可以看出，無論是樣品組還是對照組都隨冷藏時間的增加，pH值不斷下降，而與此同時酸度不斷增加。GB 19302-2010中規定，酸度應大于70.0 °T。

圖1 酸度的變化曲線Fig.1 The acidity change curve

圖2 pH值的變化曲線Fig.2 The pH change curve

圖3 活菌數的變化曲線Fig.3 Theviable count change curve

由本試驗可以看出，發酵乳制品在冷藏的第2天即發生后酸化，且隨冷藏時間的增加，后酸化越來越嚴重。發酵乳的后酸化現象是由發酵劑菌體繼續生長繁殖造成的，菌體要消耗殘存的乳糖產生乳酸，故導致發酵乳制品酸度提高。

由圖3可以看出，無論是樣品組還是對照組，其菌數都隨冷藏時間的增加而減少，這是因為發酵劑菌體本身的所處介質酸度較高，溫度較低，使發酵劑菌體生長繁殖受到一定的抑制，所以菌數逐漸減少。

2.1.7 復合中藥發酵乳的質量指標測定

按優化的工藝條件制備復合中藥發酵乳，并對3批次產品質量按GB 19302-2010進行檢測，結果見表8。本實驗復合中藥發酵乳組織均勻，口感細膩，酸甜適中，具有良好的中藥香味和乳香;蛋白質含量＞2.3%，滴定酸度115°T左右;未檢出致病菌。產品符合GB 19302-2010。

2.2 復合中藥發酵乳抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

普通發酵乳及復合中藥發酵乳對DPPH自由基清除能力結果如圖4。

由圖4可以看出，不同濃度的復合中藥發酵乳對DPPH自由基的清除能力高于普通發酵乳。中藥中的抗氧化功效成分以及中藥作為益生因子刺激了乳酸菌的生長，從而共同發揮了抗氧化作用。

表8 復合中藥發酵乳質量指標Table 8 Quality index of the Chinese herbal fermented milk

圖4 發酵乳清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging effect of fermented milk against the DPPH·radical

2.2.2 羥基自由基(·OH)的清除能力

由圖5可以看出，復合中藥發酵乳原液對·OH的清除能力最高，為75.43%;不同濃度的復合中藥發酵乳和普通發酵乳對·OH的清除能力隨稀釋倍數的增大而降低，但復合中藥發酵乳對·OH的清除能力普遍高于普通發酵乳。

圖5 發酵乳清除·OH能力Fig.5 Scavenging effect of fermented milk against the hydroxyl radical

2.2.3 Fe2+螯合能力

將2種發酵乳分別稀釋0倍、2倍、4倍、6倍、8倍后測量，結果見圖6。

圖6 發酵乳的Fe2+螯合作用Fig.6 Chelating effect of fermented milk

由表6看出，不同濃度的復合中藥發酵乳對Fe2+的螯合能力不同，原液稀釋8倍后，對Fe2+的螯合率為22.43%，高于普通發酵乳。不同濃度的復合中藥發酵乳對Fe2+的螯合能力都高于普通發酵乳。

3 結論

通過對酸棗仁、決明子、枸杞子、甘草的預處理，研究了它們對發酵乳質量的影響，并確定了復合中藥乳酸菌發酵乳的最優制備工藝，結果表明當酸棗仁、決明子、枸杞子、甘草的添加質量分數分別為2.0%、0.2%、0.5%、1.0%，干酪乳桿菌接種量為3%，發酵溫度為40℃時，中藥發酵乳在感官品質和穩定性方面都比較好。

通過發酵乳抗氧化實驗發現，復合中藥發酵乳原液對DPPH自由基清除率最高，為89.25%，且高于不添加中藥的發酵乳。復合中藥發酵乳在不同的稀釋度對·OH的清除率均高于對照的普通發酵乳，復合中藥發酵乳原液對·OH的清除率最大，為75.43%。

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