低場核磁共振結合常規理化分析海藻糖對凍藏羅非魚片品質的影響*

張珂，關志強，李敏，洪鵬志，吳陽陽

(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江，524088)

羅非魚(tilapia)又名非洲鯽魚、福壽魚、吳郭魚等，是世界上僅次于鯉科和鮭科的第三大養殖品種，是高蛋白、低脂肪的經濟魚類之一［1］。我國是羅非魚出口大國，其中冷凍羅非魚片占出口羅非魚的75%以上［2］，然而在冷藏運輸過程中，魚肉蛋白質會發生干耗、蛋白質變性、解凍后色澤不佳，汁液流失嚴重，組織纖維化現象加劇等［3］。我國羅非魚出口要經過多重的檢測、檢驗、鑒定和認證環節，然而我國大部分企業和質檢部門都缺乏先進的檢測設備和技術［4］，合適的浸漬預處理可以改善其凍藏品質，低場核磁技術的應用可為解決檢測問題提供新思路。

海藻糖一般是由2個葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵構成的非還原性二糖，其熱量為蔗糖的1/4，甜度為蔗糖的45%，以低甜度、低熱量的抗凍劑代替傳統的商業抗凍劑(4%蔗糖和4%山梨醇按質量比1∶1混合)成為了發展趨勢。近年來，許多學者證明了海藻糖具有較好的抗凍效果，可有效抑制冷凍魚糜［5］及其他魚蛋白［7］的冷凍變性。低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是指磁場強度在0.5 T以下的核磁共振，檢測對象一般針對的是樣品的物理性質［10］。根據肌肉中的水的分布不同，可將橫向弛豫時間T2分為3種類型［11］:T2b表征分子內緊密結合的水，又叫結合水;T21表征存在于肌原纖維內部的水，也稱不易流動水;T22表征存在于肌原纖維外部的水，也稱自由水。低場核磁共振技術以其無需預處理、快速、無損、樣品需要量少、實時獲得數據等特點，已在食品諸多［13］領域得到了研究和應用。而國內外采用LF-NMR技術分析不同濃度海藻糖對羅非魚片凍藏品質的影響還未見報道，本文以羅非魚為試驗對象，采用新型檢測技術——LF-NMR技術，并將其與常規理化指標進行相關性分析，直觀快速的檢測海藻糖浸漬處理后羅非魚品質的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

吉富羅非魚，購于湛江市工農市場，重約為750 g，共計12條。將健康鮮活的原料宰殺、取肉、去皮，修剪為長(100±5)mm，寬(70±5)mm，厚(9±2)mm(質量約80 g)的魚片待用。根據本實驗室前人的研究［16］得知海藻糖的適宜添加濃度為1% ～8%，故預先配制0%(空白對照組，control check;CK)、2%、8%濃度的海藻糖溶液，4%蔗糖和4%山梨醇1∶1質量比混合配置商業抗凍劑，均置于4℃冰箱待用，而后對魚片進行浸泡處理。

1.2 試劑與儀器

海藻糖，購于河南佳諾食品配料中心;蔗糖、山梨醇(＞98%)，Ca2+-ATPase測試盒和考馬斯亮藍，購于南京建成生物工程研究所;NaCl(≥96.0%)，廣東光華科技股份有限公司。

MicroMR核磁共振交聯密度儀，上海紐邁電子科技有限公司;TMS-PRO質構儀，美國FTC;GTR22-1型高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司;125型均質機，上海依背機械設備有限公司;UV-8000A紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司;HHS型恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司;AUY220型分析天平，日本島津儀器有限公司;BCD-225SDCW冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 持水性(water-holding capacity;WHC)的測定

參考Lakshmanan等人［17］的方法，稍加改動進行測定。取2.00 g切碎的魚肉置于墊有2層濾紙(事先稱重)的離心管中，然后在轉數為3 000 r/min，10℃條件下離心10 min，稱取離心后的濾紙質量，魚肉的持水性可按以下公式計算:

其中:m2是離心后濾紙質量，g;m1是離心前濾紙質量，g;m是魚肉質量，(2.00±0.01)g。

1.3.2 Ca2+-ATPase活性的測定

按照南京建成生物工程所研發的ATP酶測試盒說明進行測量，Ca2+-ATPase活性以25℃每毫克蛋白質在每分鐘內所產生的無機磷的微摩爾數表示，單位即μmolPi/(mg蛋白·h)。

1.3.3 彈性的測定

采用平底柱形探頭p/5(直徑5 mm)，樣品采用TPA模式進行測試［18］魚片質構(彈性)，具體實驗條件為:測試速率60 mm/min，壓縮程度50%，停留間隔時間5 s，環境溫度控制在18～20℃。

1.3.4 水分弛豫時間和弛豫強度的測定

凍藏羅非魚片在4℃冰箱解凍24 h后，取質量約為2.5 g，體積約為1 cm×1 cm×1 cm大小的肉塊，放入直徑約為17.0 mm的核磁管中進行測定。首先在參數設置中選擇硬脈沖序列(Hard Pulse FID)，尋找中心頻率，然后進入CPMG(carr-purcellmeiboom-gill)序列，參數設置為:主頻為22 MHz，射頻信號頻率偏移量O1=840 899.4 Hz，采樣點數TD=1 024，采樣頻率SW=200 kHz，采樣起始點D3=80 μs，重復采樣的時間間隔TR=1 000 ms，重復采樣次數NS=4，半回波時間 τ=100 μs，回波個數 EchoCnt=1 800。檢測之后進行數據反演橫向弛豫時間T2的分布情況。利用CPMG序列來檢測樣品的橫向弛豫過程，其弛豫信號的數學表達式為:

其中:M(t)為橫向磁化矢量衰減到t時間后的信號量;Pi表示樣品中第i種成分的信號強度?？傂盘柕拇笮∈滤谐煞之a生信號大小的總和，T2i表示樣品中第i種成分的橫向弛豫時間。

1.3.5 數據處理

試驗數據均為3次平行結果的平均值，用Origin 8軟件進行作圖，利用JMP 7軟件對數據進行單因素方差分析和Tukey HSD多重比較(P＜0.05為差異顯著)，利用SPSS18.0進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1 不同濃度添加劑對凍藏羅非魚片的持水性(WHC)的影響

由圖1知，4組魚片的持水性整體呈下降趨勢。添加劑組魚片在第3周時持水性略微下降，這或許是由于此時肌肉處于僵直期，pH值達到等電點，靜電荷數達到最低，蛋白質發生聚集，降低了吸引水分子的能力，從而導致肌肉持水性降低［19］;第4周時，魚片持水性又有所增大，或許是由于糖分子中大量氫鍵與蛋白質和水分子結合所致［20］。而第4周后，4組魚片持水性顯著下降(P ＜0.05)，Elisabeth［21］等人認為，或許是由于魚肉在凍藏過程中冰晶不斷擠壓細胞結構，肌原纖維蛋白變性程度變大，結合水的能力下降。魚片凍藏到第八周，2%海藻糖組和CK組顯著降低(P＜0.05)，且兩者無差異(P＞0.05);而商業抗凍劑和8%海藻糖可顯著增大持水性(P＜0.05)。

圖1 添加劑對凍藏羅非魚片WHC變化的影響Fig.1 Effects of cryoprotectants on WHC of tilapia fillets during frozen storage

2.2 不同濃度添加劑對凍藏羅非魚片Ca2+-ATPase活性的影響

如圖2所示，在凍藏的8周內，羅非魚片肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性逐漸下降，CK組顯著下降(P ＜0.05)，由 3.01 μmol Pi/(mg蛋白·h)下降到0.62 μmol Pi/(mg蛋白·h);添加抗凍劑后，酶活性下降較為緩慢，其中商業抗凍劑和8%海藻糖組中魚片的酶活性下降最小，僅降低了1.66和1.92，且無顯著差異(P＞0.05);2%海藻糖次之，此結果與Aimei Zhou等人得出結果相似。Benjakul等人［22］解釋，肌肉中Ca2+-ATPase活性的下降是由于冷凍過程中冰晶的形成改變了離子強度或者肌動球蛋白表面疏水性集團被氧化，導致肌原纖維蛋白構象的改變，從而降低其Ca2+-ATPase活性。由此說明，8%海藻糖與商業抗凍劑具有類似的抗凍效果，都可以延緩肌原纖維蛋白在凍藏過程中結構的改變，從而抑制酶活性的降低。

圖2 添加劑對凍藏羅非魚片Ca2+-ATPase活性變化的影響Fig.2 Effects of cryoprotectants on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets during frozen storage

2.3 不同濃度添加劑對凍藏羅非魚片彈性(springiness)的影響

由圖3與圖1比較可以看出，羅非魚彈性變化與其持水性變化類似，這是由于彈性與樣品恢復形變的速度和程度有關，產品質地若是過軟(即持水性較差)，恢復形變的速度就會減慢，致使彈性的得分降低［23］。由以上分析可知，第3周時肌肉處于僵硬期，故肌肉的彈性下降;隨后肌肉解僵，彈性有所恢復;而后肌肉進入腐敗期，蛋白質變性較為嚴重，肌肉的彈性開始顯著下降(P＜0.05)。同樣的，添加8%海藻糖和商業抗凍劑的羅非魚片中，由于糖分子中氫鍵與水或蛋白質的結合，延緩了蛋白質的結構改變［24］，彈性也比其余兩組顯著增大(P＜0.05)。

由以上3個理化指標的分析得到，8%的海藻糖與商業抗凍劑有同等的抗凍效果，2%的海藻糖稍差，但都比CK組能夠顯著延緩蛋白質的變性程度，提高魚肉中肌原纖維蛋白的持水性和彈性，又因其低糖低熱量的優勢，本試驗中選擇8%的海藻糖為較好的抗凍劑。

圖3 添加劑對凍藏羅非魚片彈性變化的影響Fig.3 Effects of cryoprotectants on springiness of tilapia fillets during frozen storage

2.4 以LF-NMR橫向弛豫時間T2分析魚肉中水分的變化

質子處于不同的化學環境就會導致橫向弛豫時間T2的不同，T2值越小，質子的自由度越小，T2值越大，質子的自由度越大。T2值的變化能夠反映水分子的流動性［25］，以8%海藻糖組與CK組羅非魚片為例，對T21和T22進行分析，觀察凍藏期間魚肉中水分的變化見下圖4。

圖4 添加劑對凍藏羅非魚片橫向弛豫時間T2的影響Fig.4 Effects of cryoprotectants on transversal relaxation time T2of tilapia fillets during frozen storage

根據圖4中羅非魚片橫向弛豫時間分布情況可得知，羅非魚肌肉中水分主要分為3種形式:與大分子緊密結合的水，即結合水T2b(0.1～1.0 ms);存在于肌原纖維內部的水，即不易流動水T21(10～100 ms);存在于肌原纖維網絡外部的水，即自由水T22(100～800 ms)。圖4的整體表現為:隨著凍藏時間的延長，魚片中不易流動水的橫向弛豫時間T21和弛豫強度A21減小(P＜0.05);自由水的橫向弛豫時間T21減小(P＜0.05)，弛豫強度 A22增大(P＜0.05)。僅由圖4-b可知，8%海藻糖一組內的羅非魚片在凍藏8周內不易流動水的橫向弛豫時間T21從100.00 ms下降到75.65 ms(P＜0.05)，相對應的峰面積A21也顯著下降(P＜0.05)，這與 Isabel Sánchez-Alonso［26］等人的結果相似，是由于隨著冷藏時間的延長，蛋白質變性程度變大，不易流動水含量降低。T22由464.16 ms降低到305.38 ms(P＜0.05)，對應的峰面積A22卻有所增加了(P＜0.05)，且與不易流動水連在一起，正如Bertram［27］等人所說的自由水的含量A22隨著肌肉中水分損失增加而增大，即魚片在凍藏過程中肌肉內部的水分逐漸向外部轉移。此結論與本試驗之前的測得的羅非魚持水性減小，酶活性和彈性降低呈現相同趨勢。

比較圖4-a和圖4-b中同一時期水分的弛豫時間和強度可知，8%海藻糖組的羅非魚肌肉中不易流動水的橫向弛豫時間 T21由86.97 ms增加到100.00 ms(P＜0.05)，弛豫強度A21下降較空白組緩慢;自由水的T22由351.11 ms增加到464.16 ms增大(P＜0.05)，弛豫強度A22增加也較為緩慢;結合水部分水分弛豫時間T2b和強度變化不大(P＞0.05)。這與Carla da Silva Carneiro等人［28］在凍蝦中加入三聚磷酸鈉有相似的結果，主要是由于海藻糖的加入導致肌原纖維蛋白凝膠網絡結構增大，從而提高肌肉的吸水能力和水分子的移動性，減小蛋白質變性程度。

2.5 理化指標與LF-NMR結果的比較

利用SPSS18.0軟件，以8%海藻糖組為例，將其理化指標(持水性、Ca2+-ATPase活性和彈性)與橫向弛豫時間T21和T22分別進行皮爾森相關性分析，可得出表1所示結果。

由表1可以看出，8%海藻糖處理后的羅非魚片的不易流動水和自由水的橫向弛豫時間T21和T22分布與Ca2+-ATPase活性有較好的相關性(P＜0.05)，相關系數都達到0.95以上;T21與持水性相關系數為0.952，相關度較高(P ＜ 0.05)，與 Isabel Sánchez-Alonsoa［30］提出T21與持水性直接相關的結論一致;T22與彈性也有高的相關度(P＜0.05)，可見魚片的彈性與自由水含量變化趨勢相一致。基于對核磁信號和常規理化指標的綜合對比可知，8%海藻糖在提高魚片持水力進而增加產量，延緩魚肉蛋白抗凍，改善質構等方面有較好的效果，是一種性能優良的抗凍劑。

表1 8%海藻糖處理后的羅非魚片的理化指標與LF-NMR結果的相關性Table 1 Correlations between the physicochemical parameters and the LF-NMR relaxation data of frozen tilapia fillets with 8%trehalose

3 結論

利用LF-NMR的橫向弛豫時間分析海藻糖對不同凍藏期羅非魚片品質的影響，結果表明，隨著凍藏時間的延長，魚片中不易流動水的橫向弛豫時間(T21)和弛豫強度(A21)減小;自由水的橫向弛豫時間變小(T22)，弛豫強度(A22)變大，即肌肉內部的水分逐漸向外部轉移。

添加8%海藻糖能提高魚肉蛋白質的持水性，Ca2+-ATPase活性和彈性;此外，加入8%海藻糖會使羅非魚片橫向弛豫時間T21和T22增大，即增大肌原纖維蛋白凝膠網絡結構，提高了肌肉的吸水能力和水分子的移動性，延緩了蛋白質的變性，本試驗中認為8%的海藻糖為較優的抗凍劑，且該組核磁信號與相應的持水性，Ca2+-ATPase活性和彈性等理化指標變化趨勢呈正相關(P＜0.05)。因此，LF-NMR這種無損傷、快速的新型檢測技術，可用于檢測不同加工處理后的羅非魚片水分變化，進而保證食品質量，提高經濟效益。

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