植物乳桿菌NCU116菌劑的噴霧干燥制備*

熊濤，廖良坤，黃濤，鄧耀軍

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一類對宿主有益的革蘭氏陽性益生菌［1］，能通過調節腸道菌群平衡和增強腸道黏膜抵御病原菌的入侵來發揮益生功能［2］。人們獲取益生菌的途徑主要是食用益生菌發酵的食品或服用含有益生菌活菌的藥劑，益生菌制品的生產需要高質量的菌劑作保障。目前，國際上益生菌劑的生產方式主要為冷凍干燥，然而冷凍干燥耗時長，耗能高，產量小，使得冷凍干燥的菌劑生產成本高。噴霧干燥是將物料經噴嘴霧化成小液滴，在干燥塔中經過熱交換和質交換，使物料快速干燥的一種方法［3］。由于噴霧干燥的高速率及其連續性特性，適于大規模的工業化生產［4］。自1914年 Rogers應用噴霧干燥生產出菌劑以來，國內外關于噴霧干燥制備菌劑的研究越來越多，但通過噴霧干燥制備菌劑的應用仍然沒有大的突破，噴霧干燥制備乳酸菌劑尚在試驗階段，目前世界上還沒有公司利用噴霧干燥技術規模化生產乳酸菌菌劑。噴霧干燥過程將菌體置于高溫、高滲、氧化等嚴苛的環境下，使得菌體遭受到嚴重的損傷或大量死亡，而加入保護劑通常能大大提高菌體的存活率。噴霧干燥制備的菌劑的優良與否與乳酸菌的特異性和保護劑的種類有著密切的聯系［5］，因此，研究乳酸菌的噴霧干燥技術對其應用有著重要意義。隨著研究的不斷深入，乳酸菌噴霧干燥技術從最初的條件優化進入到對細胞結構和基因表達的研究，如高溫對菌體的主要損傷部位的研究［6］，噴霧干燥過程中細胞膜的損傷［7］、菌體性能的變化［8］以及耐熱基因的研究［9］等。

目前，我國已經在發酵產業方面有了很大的發展，但是國內商業化的發酵劑生產廠家仍然極少，國內的發酵劑市場一直被國外公司壟斷，發酵產品生產企業只能依靠進口發酵劑，這極大地制約了我國發酵產業的發展，本研究在擁有自主知識產權的高性能植物乳桿菌 NCU116的基礎上，探索植物乳桿菌NCU116高濃度菌劑的噴霧干燥制備技術，以期為我國發酵劑的工業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

植物乳桿菌NCU116(Lactobacillus plantarum NCU116)，由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏。

MRS培養基的制備參考文獻［10］制備。

1.2 試劑與儀器

脫脂乳(食品級)，海藻糖(食品級)，谷氨酸鈉(食品級)，碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司;羧基熒光素乙二酸酯(CFDA)，美國Sigma公司。

B-290小型噴霧干燥儀，瑞士步琪公司;BD FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司;XL-30-E型環境掃描電子顯微鏡(SEM)，荷蘭 Philips公司;DSC-204F1型差示掃描量熱儀(DSC)，德國NETZSCH公司;Anke LXJ-IIB型離心機，上海安亭科學儀器廠;DNP-9272型生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 菌種活化培養、收集

將冷凍干燥的菌劑接入MRS液體培養基中，37℃培養16 h后，將種子液按體積分數1%的量接入到MRS液體培養基中培養18 h至對數末期，4 500 r/min離心10 min，用0.01 mol/L的PBS沖洗2次，收集菌泥。

1.4 物料制備

配制保護劑，按要求將各保護劑溶解于蒸餾水中，90℃水浴30 min，冷卻后將得到的菌泥重懸于保護劑中，混合均勻，進行噴霧干燥。

1.5 噴霧干燥

1.5.1 保護劑優化

選取脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、阿拉伯膠、明膠進行單因素試驗，并選取保護效果好的3種保護劑進行3因素3水平正交試驗設計，得到噴霧干燥復配保護劑，噴霧條件為:進風溫度135℃，物料流量240 mL/h，菌含量(3～5)×109CFU/mL。

1.5.2 噴霧參數優化

選取噴霧干燥可變參數:進風溫度、物料流量以及菌含量為工藝參數，以存活率和活菌數為響應因子，設計3因素3水平CCD響應面試驗。

1.6 細胞膜完整性

利用CFDA和PI對細胞進行雙染，CFDA可以穿透所有細胞膜，在細胞內酯酶的作用下分解出熒光基團，完整的細胞膜可將熒光基團截留在細胞內，在494 nm的激發光下發射出綠色熒光，而PI僅能穿透損傷的細胞膜，與DNA結合，在535 nm的激發光下發射出紅色熒光，通過熒光強度分析細胞膜受損與未受損細胞的量。具體操作如下:將噴霧干燥菌劑0.1 g溶于10 mL PBS中，洗滌后于4 500 r/min離心10 min收集菌泥，重懸于PBS中，加入CFDA使其質量濃度為20 μg/mL，37℃避光孵育15 min后4 500 r/min離心10 min，用PBS沖洗2次除去多余的 CFDA，再加入PI，使其質量濃度為1.2 μg/mL，4℃孵育10 min，沖洗2次除去多余染料，用流式細胞儀進行檢測，收取10 000個菌體分別計算各熒光強度［11-12］，以不添加保護劑進行噴霧干燥的菌劑作為空白對照組。

1.7 環境掃描電鏡檢測

利用環境掃描電子顯微鏡(SEM)觀察噴霧干燥后菌劑的微觀形態，取少量噴霧干燥樣品撒在粘有導電的膠性物質樣品臺上，置于電子顯微鏡樣品室中，電壓為10 kV，選擇合適的放大倍數對樣品進行掃描觀察并拍照。

1.8 玻璃化轉變溫度

利用差示掃描量熱儀(DSC)測量噴霧干燥后菌劑的玻璃化轉變溫度，取10 mg噴霧干燥樣品置于鋁盤中，另取一個空鋁盤作為參照。對樣品進行程序升溫，溫度范圍為30℃至180℃，升溫速度為10℃/min。

1.9 存儲穩定性

將噴霧干燥菌劑真空密封于鋁箔袋中，存儲于-20、4、25℃環境下，每隔10 d測定其菌數變化，共檢測60 d。

1.10 活菌計數

用MRS固體培養基進行平板涂布計數，將1 mL噴霧前的物料溶于9 mL 0.01 mol/L的PBS中或噴霧后的菌劑0.1 g溶于9.9 mL 0.01 mol/L的PBS中，振蕩混勻、梯度稀釋、涂布。將涂布平板放于37℃恒溫培養48 h后進行菌落計數，單位為CFU/mL或CFU/g。

1.11 數據處理

每個實驗重復3次，正交試驗設計分析使用Spass20.0軟件，CCD響應面采用Design-expert8.0.6設計分析，響應面、DSC曲線及存儲穩定性實驗數據采用Origin9.0作圖，存儲穩定性利用Spass20.0進行One-way ANOVA中的Tukey-HSD檢驗(P＜0.01)。

2 結果與分析

2.1 噴霧干燥結果

2.1.1 噴霧干燥保護劑優化結果

脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、阿拉伯膠、明膠是常用的噴霧干燥保護劑，圖1為6種保護劑在不同濃度下對NCU116的保護效果。由圖1可知，當脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、阿拉伯膠、明膠質量分數為10%時，各保護劑的保護效果最好，NCU116的存活率分別為:43.9%、16.3%、4.6%、10.6%、6.9%;當谷氨酸鈉的質量分數為5%時，保護效果最好，菌體存活率為:29.6%。故選取保護效果較好的保護劑:脫脂乳、海藻糖、谷氨酸鈉，進行正交試驗設計，選取最佳復配保護劑。正交試驗設計及結果如表1所示。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 One factor experiment results

表1 正交試驗及結果Table 1 Orthogonal experiment and results

Carlise［13］認為，脫脂乳能通過水取代作用保護細胞膜蛋白質在高溫過程中不發生變性。海藻糖是一種二糖，具有較高的玻璃化轉變溫度，Jimmy［14］研究認為，海藻糖通過水取代作用和玻璃態機制維持細胞膜的穩定性并降低細胞膜脂質的相轉變溫度，從而使細胞膜在高溫脫水的過程中不發生相轉變而處于流動態。Sunny［15］研究表明，谷氨酸鈉可以通過抗氧化作用保護細胞膜在高溫過程中不被氧化。

有研究表明［16］，保護劑能大大提高噴霧干燥過程中乳酸菌的存活率，然而，單一保護劑不能達到最佳保護效果，而通過各種保護劑復配，可以提高保護效果，由表1可見，通過保護劑復配，可使NCU116的存活率提高20% ～35%，當脫脂乳質量分數為5%，海藻糖為5%，谷氨酸鈉為3%時，保護效果最佳，噴霧干燥后NCU166的存活率達到69.5%，大大提高了噴霧干燥菌劑的存活率，保護劑效果:脫脂乳 ＞海藻糖 ＞谷氨酸鈉。

2.1.2 噴霧干燥條件優化結果

噴霧干燥參數對菌劑的存活率有重要的影響，有研究認為，高溫是噴霧過程中造成菌體死亡最重要的原因［17］，因此進風溫度對乳酸菌的存活率有非常重要的作用;研究表明物料流量和菌含量對乳酸菌的存活率也有重要的影響。響應面設計及結果如表2所示。

表2 響應面及結果Table 2 Response surface and results

圖2 進風溫度和物料流量對存活率的影響Fig.2 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and material flow on survival rate of L.plantarum NCU116

圖3 進風溫度和菌含量對存活率的影響Fig.3 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and microbial contents on survival rate of L.plantarum NCU116

圖4 物料流量和菌含量對存活率的影響Fig.4 Response surface plot showing the interaction of material flow and microbial contents on survival rate of L.plantarum NCU116

圖5 進風溫度和物料流量對活菌數的影響Fig.5 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and material flow on viable counts of L.plantarum NCU116

噴霧干燥過程中的高溫會對菌體結構如細胞膜、核糖體、核酸、蛋白質等造成破壞，致使細胞死亡;通過加大噴霧干燥物料流量，可使單位量的物料受熱減少，降低其中菌體的損傷;當增加物料中的菌含量時，保護劑對菌體的相對保護作用降低，導致菌體損傷加劇。如圖2～4所示，噴霧干燥菌劑的存活率隨著進風溫度的升高而降低，隨物料中菌含量的增加，NCU116存活率先增加再降低，隨物料流量的增加而升高。由圖5～7可見，產品的活菌數隨物料中菌含量和物料流量的增加而增加，隨進風溫度升高而減少。通過Design-expert軟件分析，得到噴霧干燥的最佳參數為:進風溫度125℃，物料流量320 mL/h，菌含量為10.25 lgCFU/mL，經過噴霧干燥后，NCU116存活率為89.95%，活菌數達到10.96 lgCFU/g，通過驗證，表明實驗值與預測值相吻合。

圖6 進風溫度和菌含量對活菌數的影響Fig.6 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and microbial contents on viable counts of L.plantarum NCU116

圖7 物料流量和菌含量對活菌數的影響Fig.7 Response surface plot showing the interaction of material flow and microbial contents on viable counts of L.plantarum NCU116

2.2 細胞膜完整性

研究表明，噴霧干燥過程中的高溫造成的細胞死亡與細胞膜的完整性相關，細胞膜的損傷造成細胞內容物的外泄，導致細胞死亡［18］。流式細胞儀檢測結果如圖8所示。

如圖8-B所示，不添加保護劑時，Q4區域僅有1.12%，Q1區域為69.80%，表明絕大部分細胞的細胞膜在噴霧干燥的過程中受到高溫損傷;當使用復配保護劑后，流式細胞檢測如圖8-C所示，Q4區域的量顯著增加，達到49.75%，而Q1區域的量僅為7.80%，表明復配保護劑降低了噴霧干燥過程中高溫對細胞膜的損傷，復配保護劑對菌體的保護作用明顯。李寶坤［19］研究表明，在冷凍干燥制備乳酸菌菌劑的過程中加入保護劑后，細胞膜的損傷明顯減少，這與噴霧干燥制備菌劑的結果相同，說明無論是噴霧干燥的方式還是以冷凍干燥的方式制備菌劑，選取適當的保護劑對細胞結構的完整性都有重要的作用。

圖8 流式細胞圖Fig.8 Flow cytometric fluorescence dot plot

2.3 SEM檢測

如圖9所示，SEM觀察到的微觀結構顯示復配保護劑對菌體的包埋效果良好，微粒呈現球形和不同的顆粒大小，由于水分的蒸發，顆粒表面有典型的凹陷和褶皺，外表面未出現裂紋，這對保護微球內部菌體免受高溫損傷及防止存儲過程中細胞膜脂質的過氧化有重要的作用，菌劑顆粒大小為10～18 μm。這一結構特性與冷凍干燥制備的菌劑微觀結構有非常明顯的差異，在噴霧干燥過程中霧滴由于高溫的作用使水分迅速蒸發，使得菌劑的顆粒呈現球形并出現褶皺;在冷凍干燥過程中，水由冰晶直接升華而失去水分，菌劑微觀結構呈現出塊狀并具有許多孔洞［20］，因此冷凍干燥制備的菌劑表現出易吸水的特性，而噴霧干燥制備的菌劑吸水性較弱。

圖9 噴霧干燥菌劑SEM圖Fig.9 SEM pictogram of spray drying starter culture

2.4 玻璃化轉變溫度

菌劑在存儲中的穩定性與菌劑的狀態有密切的聯系，有研究表明，當菌劑處于玻璃態時，分子流動性被抑制，細胞膜的氧化和化學反應降低，減緩細胞在存儲過程中的死亡［21］。

圖10為最佳噴霧干燥條件下制備的菌劑的DSC曲線，由曲線可知，噴霧干燥制備的菌劑 Tg為79.50℃，說明在常溫下，菌劑處于玻璃態，這對保持NCU116菌劑的穩定性有非常重要的作用。

圖10 噴霧干燥菌劑DSC掃描圖Fig.10 DSC thermograph of spray drying starter culture

2.5 存儲穩定性

高質量的菌劑不僅要求得到的產品活菌含量高，還需要在存儲過程中保持活力穩定［22］，因而需要找到最佳的存儲條件。圖11為不同溫度條件下，菌劑的活菌數隨存儲時間的變化。

圖11 不同溫度存儲活菌數變化Fig.11 Viable counts change in different storage temperature

由圖11可知，在不同溫度下存儲時，菌劑活菌數變化差異明顯，當存儲于-20℃時，菌劑的穩定性良好，經過60 d，菌數下降了0.52個對數值;存儲于4℃時，經過60 d，菌數下降了1個對數值;在25℃條件下存儲時，菌數下降明顯，經過60 d，活菌數降低了2.31個對數值。雖然菌劑在所有存儲溫度下都處于玻璃態，但不同存儲溫度下的穩定性呈現顯著差異(P＜0.01)，表明菌劑的穩定性不僅與是否處于玻璃態有關，還與存儲溫度有密切的聯系，處于玻璃態是確保菌體被固定在玻璃態基質中，更低的溫度對NCU116菌劑保持其穩定性也具有非常重要的作用。低溫可以降低酶的活性和減緩化學反應的發生，這對保持菌劑的穩定性有利。Thomas［23］研究發現，冷凍干燥制備的菌劑存儲穩定性也隨著溫度的升高而降低，在4℃存儲60 d后，活菌數下降了1個對數值，而在25℃存儲60 d后，活菌數下降了2個對數值，這與本文通過噴霧干燥制備的菌劑存儲穩定性結果相近。這一結果表明通過噴霧干燥制備的菌劑與通過冷凍干燥制備的菌劑在不同溫度下的存儲穩定性基本一致。

3 結論

本文探究了植物乳桿菌NCU116菌劑噴霧干燥制備的最佳工藝條件，最佳保護劑為:脫脂乳質量分數為5%、海藻糖為5%，谷氨酸鈉為3%;最佳噴霧條件為:進風溫度125℃，物料流量320 mL/h，菌含量10.25 lg CFU/mL，此時，噴霧干燥后NCU116存活率為89.95%，活菌數達到10.96 lg CFU/g。通過流式細胞術檢測噴霧干燥菌劑的細胞膜完整性，添加保護劑后，細胞膜的損傷顯著降低;在最佳條件下制備的NCU116菌劑微觀形態、結構良好，在存儲溫度下都處于玻璃態，但存儲過程中菌劑穩定性差異較大，在-20℃存儲時，菌劑穩定性較好。本文通過系統研究噴霧干燥制備植物乳桿菌NCU116菌劑的工藝條件及其菌劑特性，并制備出高濃度的植物乳桿菌NCU116菌劑，將為益生菌更廣泛的應用及國內發酵劑市場的發展提供理論支持，對利用噴霧干燥技術大規模生產益生菌劑有重要的指導作用。

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