外源氮元素添加對醋糟厭氧發酵產氫的影響*

邵淑萍，張存勝，王振斌，任曉鋒，2，崔鳳杰，趙鵬翔，張軍宏

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇鎮江，212013)

2(工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457)

3(國網節能服務有限公司北京生物質能源技術中心，北京，100081)

近幾年來國內外在醋糟的利用方面進行了較為廣泛的研究，目前醋糟的利用主要集中在“飼料資源”、“食用菌栽培料”和“植物無土栽培基質”等方面。由于醋糟的蛋白質含量較低，而粗纖維含量較高，消化率低、適口性差，所以不可用于單一飼喂。作為食用菌栽培料和植物無土栽培基質，存在著處理量小、耗能大等缺點，不能滿足當前對醋糟進行大批量處理的要求。直接燃燒法可以實現對大批量醋糟的處理，但會造成大量的粉塵污染，且浪費了醋糟中的蛋白質、淀粉等有機營養物質。因此，選擇一種合理的醋糟處理方式很有必要［1-3］。

厭氧發酵技術已被有效地應用于農業有機廢棄物資源化處理，可以將低值有機資源轉化生物能源和有機肥料［4］。以醋糟為研究對象，通過厭氧發酵技術制備氫氣和甲烷等生物能源氣體和有機肥，為其合理化利用提供了可能［5-6］。有文獻總結了產氫的最佳C/N為33～45［7-8］，在醋糟厭氧發酵產氫過程中發現，由于醋糟纖維素、半纖維素和木質纖維素等碳水化合物含量高，C/N高，直接影響了產氫微生物的生長，使得水解效率和產氫效率降低。針對此類問題，王志民［9］等在馬鈴薯薯渣厭氧發酵過程中添加2% ～2.5%尿素，陳廣銀［10］等對不同氮源對麥稈厭氧發酵過程和體系氮形態的變化進行了研究。然而，目前對于醋糟不同氮元素添加后厭氧制氫產率、發酵類型及發酵前后氮形態變化的影響并沒有相關報道。

本文首先確定了醋糟發酵產氫的最佳C/N。通過添加氯化銨、尿素和硝酸鉀分別代表有機氮、氨基氮和硝基氮，在確定最佳C/N的條件下，對其產氣特性、發酵液成分變化以及發酵前后氮形態的轉化進行了較系統研究，考察了外源氮元素添加對醋糟厭氧發酵產氫過程的影響，以期為醋糟的厭氧發酵提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

醋糟:新鮮醋糟取自鎮江恒康調味品廠，自然風干，置于干燥陰涼處備用。

接種物:產氫菌通過活性污泥馴化后得到。污泥取自江蘇大學鏡湖，過2 mm篩去除枝葉等雜質，先于40 L污泥罐中培養3個月至最大活性，用6 mol/L的NaOH調整pH至12.0±0.1，室溫維持24 h，抑制污泥中的產甲烷細菌，用6 mol/L的HCl調節pH至6.0±0.1備用。

分析純試劑:氯化銨、硝酸鉀和尿素。

醋糟和活性污泥的特征列于表1。

表1 醋糟和活性污泥的特征Table 1 Characteristics of the raw vinegar residue and anaerobic sludge

1.2 醋糟厭氧發酵過程

將30 g總固形物(Total Solid，TS)的醋糟與pH調至1的HCl以料液比10 mL/g混合，于99℃水浴加熱30 min后冷卻至室溫，加入氮源。300 mL預處理過的活性污泥與30 g TS預處理的醋糟混合于1 L發酵瓶，用蒸餾水補足有效體積800 mL，用6 mol/L的NaOH和HCl將系統的初始pH調至6.0±0.1，迅速加塞密封充入高純氬氣制造厭氧環境。于37℃水浴鍋進行厭氧發酵產氫實驗。每組做3次平行實驗。產生的氣體通過排水法收集，取厭氧發酵前后的發酵液對氨氮NH3-N、硝基氮NO3-N、亞硝基氮NO2-N、總氮(Total Nitrogen，TN)和揮發性脂肪酸(Volatile Fatty Acid，VFA)進行進一步分析。

1.3 添加氮源實驗過程

首先以尿素為氮源，考察不同 C/N(20、30、40、50)對醋糟厭氧發酵產氫的影響;在確定最佳C/N的條件下，以尿素、氯化銨和硝酸鉀分別代表有機氮、氨基氮和硝基氮，研究不同外源氮元素對產氫過程的影響。

1.4 化學分析

總固形物 TS、揮發性固形物 (Volatile Solid，VS)、pH、還原糖、NH3-N、NO3-N、NO2-N 和 TN 通過標準方法測定［11］;總碳通過TOC分析儀測定(TOCV，Shimadzu日本);蛋白質含量通過凱氏定氮測定。

用氣相色譜儀(SP-6890，魯南瑞虹，中國)進行氣體成分的測定，氣相色譜儀為TCD檢測器，裝有TDX-01不銹鋼柱(2 m×3 mm，配碳分子篩)。進樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為140、160和160℃。載氣為氬氣，檢測器電流60 mA壓力0.08 MPa，流速25 mL/min。

液相產物的揮發性脂肪酸(VFAs)由氣相色譜儀(GC-5890，HP)檢測，配有氫離子檢測器(FID)和毛細管柱(安捷倫1909/N-133HP-INNOWAX 30 m×0.250 mm)。FID的進樣口和檢測器溫度分別為240℃和260℃。柱溫程序升溫:初溫100℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至220℃保持5 min。氮氣作為載氣，氮氣、氫氣和空氣的流速分別為290 mL/min，170 mL/min和290 mL/min。

1.5 數據分析

應用ORIGIN8.0數據處理軟件對數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 最佳C/N的確定

醋糟的有機質含量較高，其TS、VS和VS/TS分別達到30.8%、27.4%和89.1%(表1)，表明醋糟適合發酵產氣?；钚晕勰嗟腣S/TS只有20%，表明污泥缺少有機質。此外，作為發酵底物的醋糟總碳含量為35.6%，總氮含量只有0.56%，表明醋糟富含碳水化合物。其C/N高達64，高于發酵產氫的最佳碳氮比［7-8］，不適合直接用于厭氧發酵。因此在實驗中需要加入一定量氮源。

圖1 C/N對產氫的影響Fig.1 Effect of C/N on hydrogen yield

圖1為通過添加尿素調節不同的C/N得到的累積產氫量。由圖1可得:加入適量的尿素均可以顯著提高氫氣產量，表明添加適量氮源能夠提高產氣量。這是因為添加氮源提高了厭氧微生物的活性，促進了醋糟中有機物向氫氣的轉化［12］。C/N為40時氫氣產量最高，比對照組提高了42%。Chakkrit［13］等報道的最佳C/N 33.14，活性污泥中的微生物混合菌群不同導致最佳C/N有所區別。C/N(20)較低時產氫量反而低于對照組，這是因為由蛋白質和其他氮成分轉化成的游離氨離子會抑制細胞生長，從而降低產氣量［14］。結果表明合適的碳氮比可以促進發酵的進行，提高氫氣產量。本研究得到醋糟產氫的最佳C/N為40。

2.2 添加不同氮源對產氫過程的影響

表2為添加不同氮源后發酵體系的產氣特性和發酵液的成分變化。從表2可以得到，添加以氯化銨為代表的氨氮氮源、硝酸鉀為代表的硝基氮源和尿素為代表的有機氮源，醋糟的產氣量均有不同程度的增加，表明添加適量氮源能夠促進發酵的進行。最終產氣量以氨氮氮源組增加最多，氫氣含量達到85 mL/g-VS，其次為有機氮源組，硝基氮源組產氣量最少，氫氣產量分別提高了57%、46%和21%。各實驗組氫氣濃度均在60%～62%。還原糖的利用率較對照試驗均有提高，尤其是氯化銨組，還原糖的利用率達到73.5%，對應著最高氫氣產量。表明適量的加入氮源有利于還原糖等有機質的充分利用，提高產氣量。

表2 不同氮源對產氫過程的影響Table 2 The influence of different N resource on digestion process

總酸含量發酵前基本一致，均低于2 500 mg/L，發酵后VFA含量與氫氣產量增減趨勢一致，累積VFA的最高含量為9 282 mg/L，出現在累積產氫量最高的氯化銨組，結果表明產氫過程會造成VFA的積累。VFA的積累會造成pH的下降，然而本實驗各加氮組中總酸含量均顯著高于對照組，而pH卻高于對照組的5.04，表明氮源的加入起到緩沖劑的作用，能夠有效調節系統的酸堿度。尿素等轉化的氨氮呈堿性，也有助于調節發酵過程的pH，維持系統的穩定性。

圖2為發酵末端產物中VFA組成。由圖2可以看出，發酵后各組的VFA主要成分是乙醇、乙酸和丁酸。其中每組都是乙酸含量最高，酸的生成能為固氮酶提供ATP有助于產氫，所以在產氫良好情況下乙酸的濃度比較高［15］。對照組和尿素組的丁酸含量僅次于乙酸含量，屬于丁酸型發酵，這是碳水化合物類的典型發酵類型［16］。加入氮源后，各組的乙醇含量較對照組都有所上升，體系pH維持在5.2左右。氯化銨組和硝酸鉀組中乙醇含量高于丁酸，呈現以乙醇為主要液相末端產物、產氫率高的代謝特征。這表明添加適量的氮源可以將系統轉化為促進產氫的乙醇型發酵。這是因為形成丁酸型發酵類型的典型微生物是梭菌屬，而乙醇型發酵起主要作用的微生物為消化鏈球菌屬，氮源的添加改變了污泥厭氧發酵體系中的優勢產酸菌群而促使不同厭氧發酵類型的形成［17］。加入氮源后丁酸含量降低是最終pH升高的原因之一。除乙酸和丁酸，發酵液中還有丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸和己酸存在，但它們的含量均低于300 mg/L，不會對產氫菌活性造成抑制［18］。

圖2 不同氮源對VFA組成影響Fig.2 The influence of different N resource on VFA composition

表3 發酵前后氮形態的組成Table 3 The composition of N form before and after digestion

表3為加入不同氮源后發酵體系內不同形態氮的轉化。厭氧發酵過程伴隨著各種形態氮素的相互轉化，厭氧微生物分解有機物，將有機物中的有機氮轉化為無機氮，與此同時，微生物利用系統中的無機氮轉化為有機氮。由表3可得，實驗各組在發酵后的總氮含量均有所升高，表明醋糟中的有機氮被大量分解轉化為無機氮溶入發酵液中，其中一些不能為厭氧微生物分解的有機物也溶出進入發酵液中。醋糟被發酵的含氮物質高于發酵過程被利用的含氮物質使得總氮含量升高。

氮的轉化過程包括氨化、硝化和反硝化3個階段。氨氮在亞硝化桿菌的作用下可以生成亞硝酸鹽，并在硝化桿菌作用進一步形成硝酸鹽，同時水中的亞硝酸鹽也可以在厭氧條件下受微生物作用轉化為氨［19］。各實驗組氮主要以氨氮形式存在，除了硝酸鉀組，添加氮源對系統的亞硝基氮和硝基氮的含量影響不大。發酵前后，亞硝基氮和硝基氮的含量均有明顯下降，表明它們在發酵過程中被利用。對于氨氮形態，添加氯化銨組氨氮含量降低，硝酸鈉組氨氮出現大量積累，尿素組在發酵后氨氮含量略有上升。說明厭氧發酵過程中同時發生了氨化作用和硝化作用，以氨化作用為主。當氨氮濃度達到200 mg/L時，會產生氨氮的抑制作用［20］，而本實驗由于氮源含量很低，最高的氨氮含量22.69 mg/L遠低于抑制濃度，氨氮沒有產生抑制作用，反而作為無機氮源被發酵利用，促進發酵的進行。

3 結論

(1)醋糟發酵產氫的最佳C/N為40。添加外源氮元素可以提高醋糟發酵產氫性能。在各種氮源中，以添加氨氮的效果最好，氫氣產量達到85 mL/g-VS，較對照組提高了57%。

(2)添加氯化銨和尿素可將發酵類型由丁酸型轉變為乙醇型，促進氫氣產率的提高。

(3)厭氧發酵后發酵液中總氮含量均有增加;發酵液中的氮以氨態氮為主，氨化作用強于硝化作用，部分氨氮可以作為有機質被利用;除硝酸鉀組，添加氮源對發酵液中硝態氮含量的影響不大，發酵后硝基態氮含量均有下降。

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