不同發酵方式下泡青菜的品質分析*

賈秋思，何芝菲，羅佩文，何利，周康，胡欣潔，韓新鋒，顏正財，劉書亮，胡濱

1(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)2(四川吉香居食品有限公司，四川眉山，620039)

泡菜是我國民間大眾化的蔬菜加工食品，富含以乳酸菌為主的益生菌群，不僅具有獨特的口味，而且具有凈腸［1］、抗動脈硬化和抗肥胖［2］、延緩衰老［3］、抗癌［4-5］等多種保健功能。但目前，我國泡菜生產企業多使用自然發酵或高鹽腌制方式生產，產品發酵周期較長、亞硝酸鹽含量較高、品質不穩定，無法滿足市場的要求，制約了我國泡菜行業的發展［6-7］。

直投式乳酸菌發酵劑是指高濃度的乳酸菌懸浮液添加抗凍保護劑后，經凍結、真空條件下升華干燥而制成的粉末狀固體發酵劑［8］，其特點主要有:接種方便，活菌含量高(109～1012CFU/g)，保質期長，不需要活化便可直接應用于生產［9］。采用直投式乳酸菌發酵泡菜可顯著縮短泡菜的發酵周期，改善發酵泡菜的品質，同時在發酵初期，過氧化氫、雙乙酰等抑菌性物質的產生能有效地抑制不耐酸的雜菌的生長，降低亞硝酸鹽含量，提高產品質量和穩定性［10］。以葉用芥菜為原料生產的泡青菜或酸菜，可鮮食、也可廣泛用作酸菜魚、酸菜燉肉、酸菜湯等烹飪食品的佐料，市場占有量大。本實驗采用自然發酵、老鹽水發酵、直投式乳酸菌發酵方式制作泡青菜，分析3種發酵泡青菜的感官、理化和微生物指標的動態變化，比較3種發酵方式的特點及產品間的差異，為改進泡青菜生產發酵工藝，提高產品品質提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心芥筍殼青菜(也稱芥菜，Brassica juncea)，于青菜實驗田采集;干辣椒、花椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、冰糖、白酒、食鹽，購自農貿市場。

直投式乳酸菌菌劑:耐鹽戊糖片球菌PP，高效降亞硝酸鹽植物乳桿菌N2，產廣譜細菌素植物乳桿菌P158，調整菌含量均約為1010CFU/g，備用。

培養基:MRS培養基;平板計數瓊脂(PCA)、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂(PDA)，購于杭州微生物試劑廠。

主要藥品:蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、瓊脂粉等均為生化試劑(BR);K2HPO4·3H2O、CH3COONa、(NH4)2HC6H5O7、MgSO4、MnSO4等均為分析純試劑(AR)。

主要儀器:DHG-9162電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司;UV-3200紫外可見分光光度計，四川新科儀器有限公司;Thermo BR4i型冷凍離心機，Thermo Electron Corporation;氣相色譜-質譜聯用儀GC-MS(GP2010)，島津國際貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泡青菜制作

自然發酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，根據蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內加含鹽量為60 g/L的涼開水和適量輔料，壇沿加水密封，于20℃培養，每24 h測定泡菜的pH值，當pH值降至3.6［11］，總酸含量達到0.4%時，結合發酵蔬菜色澤、口感等確定發酵終點。

老鹽水發酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，向壇內加40%的老鹽水和適量輔料，根據蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內添加剩余所需的鹽水(鹽含量約60 g/L)，壇沿加水密封，于20℃培養，每24 h測定泡菜的pH值，當pH值降至3.6，總酸含量達到0.4%時，結合發酵蔬菜色澤、口感等確定發酵終點。

直投式乳酸菌劑發酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，根據蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內加含鹽量為60 g/L的涼開水和適量輔料，并按青菜總質量的0.05%添加乳酸菌劑粉末至壇內(3株菌劑按 PP∶P158∶N2=1∶0.5∶0.5添加)，壇沿加水密封，于30℃培養，每24 h測定泡菜的pH值，當pH值降至3.6，總酸含量達到0.4%時，結合發酵蔬菜色澤、口感等確定發酵終點。

1.2.2 品質測定

在泡青菜發酵過程中，于 0、1、2、3、4、5、6、9、12 d分別對3種發酵方式的泡青菜在泡菜壇內的上、中、下3層的位置進行取樣混合，測定其各項理化、微生物指標及發酵成熟后泡青菜的揮發性風味物質并進行感官評價。

1.2.2.1 感官評定

感官評價邀請食品專業同學和老師共10人作為感官評價人員，采用加權法，考察色澤、形態、氣味、口感和脆度五個方面進行感官評價，對應的評價得分集={很差(2)，較差(4)，一般(6)，較好(8)，很好(10)}，評價結果用SPSS軟件進行分析。具體評價標準及得分權重見表1。

表1 感官指標評定標準［12］Table 1 Criterion of sensory evaluation

1.2.2.2 部分理化指標測定

pH值:參照GB/T 10468—1989;亞硝酸鹽:鹽酸萘乙二胺法，參照 GB 5009.33—2010;Vc:2，6-二氯靛酚滴定法，參照GB/T 6195—1986;總酸:酸堿中和法，參照GB/T 12456—2008。

1.2.2.3 部分微生物指標的測定

細菌菌落總數:參照GB 4789.2—2010;酵母菌數:參照 GB 4789.15—2010;乳酸菌數:參照 GB 4789.35—2010。

1.2.2.4 揮發性風味物質的測定

采用同時蒸餾萃取(SDE)和GC-MS對泡青菜的揮發性風味物質進行提取和測定。稱取200 g樣品于研缽中研磨至勻漿，取100 g勻漿與500 mL蒸餾水放入1 L圓底燒瓶中，將50 mL乙醚加入裝置中的另一側250 mL燒瓶中，將裝置樣品端置于電爐上，保持微沸，另溶劑端置于40℃水浴鍋中，蒸餾萃取2 h，之后向提取液中加入一定量的無水硫酸鈉，置于冰箱中過夜除水。真空旋轉蒸發濃縮至1 mL，于GC-MS進樣分析。

GC-MS檢測條件［13］:色譜柱:Rtx-5MS彈性石英玻璃毛細管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);載氣:氦氣;進樣溫度:250℃，分流比10∶1;進樣量:1 μL;升溫程序:初溫40℃保持2 min，5℃/min上升至80℃，保持1 min，8℃/min上升至180℃/min，保持1 min，再以15℃/min上升至240℃，保持8 min。

離子源溫度:200℃;電子能量:70 eV;放射電流:150 μA，檢測電壓350 V;電離作用模式:EI+，掃描范圍(m/z):35～450。

揮發性風味物質數據處理:樣品經過GC-MS分析后，各香氣成分的質譜圖經計算機譜庫(NIST05)匹配檢索及相關資料分析，對數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 不同發酵方式過程中的泡青菜感官評價結果

從表2中可看出，在發酵初期，感官得分較低，可能由于泡菜鹽水中的各種風味成分沒有滲入青菜組織中，且發酵尚未成熟，所以泡青菜較咸且伴有生青菜味，色澤呈青色，發酵香味差;隨著發酵時間的延長，泡青菜的色澤逐步由青綠色轉變為金黃色，伴有發酵清香氣味，微生物發酵產生的酸也逐步賦予泡青菜酸爽的口感，感官得分逐步提高。從發酵初期到發酵終點，3種發酵方式的泡青菜感官評價得分均存在顯著差異(P＜0.05)，從總體上看，直投式乳酸菌發酵泡青菜色澤金黃，咀嚼脆性好，感官評分最高，明顯優于其他兩種發酵方式的泡青菜，與李文婷、余文華等［14-15］的研究結果吻合。自然發酵泡青菜風味較清淡，略有苦澀味，得分最低。

表2 不同發酵方式下泡青菜感官評定結果Table 2 Results of sensory evaluation of mustard pickles during different fermentation

2.2 不同發酵方式下泡青菜的理化指標

2.2.1 不同發酵方式下泡青菜pH的變化情況

pH值是泡菜發酵過程中的一項重要指標，它對乳酸菌動態變化、微生物的生長和代謝產物的形成有著重要的影響［16］。當泡菜pH為3.5～3.8時，泡菜即成熟且風味品質最佳［11］。由圖1可以看出，3種發酵方式的泡青菜pH變化趨勢基本一致，直投式乳酸菌發酵泡青菜pH下降速度最快，在發酵第6天時降至3.54，老鹽水與自然發酵泡菜的pH分別在第9天和第12天降至3.6以下。由此可以看出，使用直投式乳酸菌發酵泡青菜，可在一定程度上縮短泡青菜的發酵周期。

圖1 不同發酵方式下泡青菜pH的變化Fig.1 Changes of pH in mustard pickles during different fermentation

2.2.2 不同發酵方式下泡青菜總酸的變化情況

從圖2可以看出，3種發酵方式的泡青菜在整個發酵過程中總酸變化趨勢基本一致。在發酵初期，泡青菜中的水分、糖分等可溶性成分向外滲出，泡菜水的鹽濃度降低，抗鹽較強和抗鹽較弱的微生物可同時活動，此時乳酸菌含量不高，產酸較低［11］。發酵前2天總酸含量緩慢上升，在第3天均出現一個最低點，這可能是由于在整個過程中，泡菜自身的酸性物質如蘋果酸、檸檬酸等不斷向泡菜液中滲透或被分解，而乳酸菌發酵產生乳酸，造成泡菜和泡菜液之間酸性物質的相互滲透、擴散［17］。發酵3天后，總酸含量隨著發酵時間延長、乳酸菌濃度升高而逐步增加，至發酵第9天后，自然發酵泡青菜總酸含量趨于穩定，而直投式乳酸菌發酵和老鹽水發酵泡青菜總酸含量仍呈一定程度的上升趨勢，這是由于自然發酵泡青菜是利用青菜表面附著的微生物進行發酵，由于泡菜發酵時間較短，其中存在的乳酸菌適應酸的過程相應較短，因此通過自然篩選存在的耐酸乳酸菌比例可能相對較少，在發酵后期總酸的大量累積，使自然發酵泡青菜中乳酸菌的生長代謝被抑制;而直投式乳酸菌發酵泡青菜中的乳酸菌是經過選擇的具有一定耐酸能力的乳酸菌，且老鹽水發酵泡青菜的泡菜水是經過較長時期選擇的優質泡菜水，其中含有較多耐酸性較強的乳酸菌，因此發酵后期的酸環境對其生長影響均相對較弱，使發酵后期總酸含量仍呈一定程度上升趨勢。發酵至12天時3種發酵方式相比，老鹽水發酵泡菜的總酸含量最高，其次是直投式乳酸菌發酵泡菜，自然發酵泡菜的總酸含量最低。

圖2 不同發酵方式下泡青菜總酸的變化Fig.2 Changes of total acid in mustard pickles during different fermentation

2.2.3 不同發酵方式下泡青菜亞硝酸鹽的變化情況

亞硝酸鹽是合成強致癌物質亞硝胺類化合物的前體物質，容易在泡菜等發酵食品中累積［18］。圖3顯示，泡菜亞硝酸鹽含量隨發酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢。在發酵初期，有氧環境下，乳酸菌含量少，雜菌含量多，泡菜液pH值高，亞硝酸鹽含量逐步升高并出現一個峰值;隨著乳酸菌含量的增加，泡菜酸度逐步升高，硝酸鹽還原菌的生長被抑制，同時亞硝酸鹽在酸性環境中發生化學降解或酶降解［19-20］，致亞硝酸鹽含量逐步降低。直投式乳酸菌發酵泡青菜于發酵第2天出現亞硝峰，峰值為7.63 mg/kg，老鹽水發酵泡青菜于第3天出現亞硝峰，峰值為9.39 mg/kg，自然發酵泡青菜亞硝峰出現最晚，峰值最高，為16.21 mg/kg，直投式乳酸菌發酵泡青菜亞硝酸鹽出峰時間相對較早，峰值較低，降解速度快，優于自然發酵和老鹽水發酵，表明人工接種乳酸菌有利于抑制亞硝酸鹽的生成或降解生成的亞硝酸鹽，減少亞硝酸鹽的積累。證實了本實驗接入的植物乳桿菌N2具有較好的降解亞硝酸鹽能力［21］。有研究表明，泡菜中亞硝酸鹽的生成與變化規律隨食鹽濃度的不同而異，食鹽含量低，出峰時間早［22］，本實驗相對其他泡菜研究［23］報道的亞硝酸鹽峰值出現的時間較早，這可能是由于本實驗食鹽添加量較低所致。3種發酵方式泡青菜成品的亞硝酸鹽含量均符合四川泡菜地方標準(≤10 mg/kg)。

圖3 不同發酵方式下泡青菜亞硝酸鹽的變化Fig.3 Changes of nitrite content in mustard pickles during different fermentation

2.2.4 不同發酵方式下泡青菜Vc的變化情況(圖4)

圖4 不同發酵方式下泡青菜Vc的變化Fig.4 Changes of vitamin C in mustard pickles during different fermentation

Vc易溶于水，在空氣中易被氧化，但在酸性條件下穩定，因此泡菜發酵過程中產生的酸對Vc具有一定的保護作用。青菜中Vc含量較高，但在發酵液滲透作用下會有部分損失，且Vc具有二烯醇結構，有極強的還原性，而裝壇時壇內有一定量的氧氣，Vc在有氧條件下發生氧化還原反應被氧化，因此發酵前期Vc量降低幅度較大;在發酵中后期，青菜發酵的厭氧環境及乳酸菌產酸形成的酸性環境可以抑制Vc氧化，有利于Vc保存，Vc的下降趨于緩和，直投式乳酸菌發酵泡青菜的Vc含量相對較高。

2.3 不同發酵方式過程中泡青菜菌相的變化情況

由圖5、圖6、圖7可以看出，在發酵初期老鹽水發酵和自然發酵中的乳酸菌含量較低，隨著發酵的進行，乳酸不斷積累，pH下降，老鹽水和自然發酵中的乳酸菌分別在第4和第5天成為發酵優勢菌。直投式乳酸菌發酵由于接入了一定量的乳酸菌，從發酵初期乳酸菌就是發酵優勢菌，對酵母菌的抑制作用相對其他兩種發酵方式更明顯。直投式發酵的乳酸菌在第4天為107CFY/g，第6天達到108CFU/g，發酵末期略有下降，自然發酵和老鹽水發酵分別在第5和第9天達到107CFU/g。在整個發酵過程中，自然發酵泡青菜與老鹽水發酵泡青菜乳酸菌的增長速度及含量均低于直投式發酵泡青菜，進一步確認直投式乳酸菌發酵泡青菜可縮短發酵時間，且乳酸菌含量較高，從細菌菌落總數看出，它能有效抑制雜菌的生長。

圖5 自然發酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.5 Changes of mustard pickles microflora during natural fermentation

圖6 直投式乳酸菌發酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.6 Changes of mustard pickles microflora during direct vat set fermentation

2.4 不同發酵方式下泡青菜的揮發性風味物質

圖7 老鹽水發酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.7 Changes of mustard pickles microflora during aged brine fermentation

經SDE和GC-MS檢測，分別從自然發酵、直投式乳酸菌發酵、老鹽水發酵泡青菜中鑒定出81、91、92種香氣成分，其成分主要包括烴類、酯類、酸類、醇類、硫醚類、醛類等，其中以烴類、酯類和醇類的成分最多。烴類包括烷烴和烯烴，而烷烴香氣閾值較高，賦予泡菜的香氣作用較小，烯烴相對烷烴閾值較低并具有特殊香氣，作用較大。

一般泡菜中的風味物質有3大來源，1是泡菜原料(蔬菜和香辛料)本身的風味物質(如花椒中的檸檬烯，青菜中的酸類、醇類等)，2是乳酸菌發酵產生的風味物質(如乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乙酸乙酯等)，3是其他菌群發酵產生的風味物質(如酵母菌發酵)。由表3可以看出，3種發酵泡青菜中異硫氰酸酯類含量占比較大，它是辣味的前體物質——芥子油苷經硫苷酸酶水解得到的，是十字花科蔬菜的獨特風味組分［24］。該類物質在直投式乳酸菌發酵泡青菜中的含量明顯高于其他兩種發酵泡青菜，這是由于Vc能顯著提高硫苷酸酶活性［25］，且異硫氰酸酯類物質在酸性條件下穩定。

表3 不同發酵方式下的泡青菜揮發性風味物質主要組分及其相對含量Table 3 Component of volatile flavor compounds in mustard pickles with different fermentation methods

老鹽水發酵泡青菜其總酸含量雖略高，但Vc含量相對較低，自然發酵泡青菜總酸含量較低，其發酵環境不適宜該類物質的生成。另外，由發酵產生的乙酸等酸類物質可適當中和泡菜的芥辣刺激味，賦予泡青菜酸爽可口的風味。醛類和芳香族化合物的香氣閾值較低，為賦予泡青菜風味提供了較大作用。3種發酵方式其揮發性風味物質的類別相似，但各組分的種類和含量具有一定差異，直投式乳酸菌發酵泡青菜和老鹽水發酵泡青菜的風味成分較為接近，其相同組分占直投式乳酸菌發酵泡青菜種類的57.14%。

目前對直投式發酵與老鹽水發酵泡青菜品質的對比研究較少，因此進一步對直投式發酵及老鹽水發酵泡青菜進行深入研究，尤其是對其微生物菌群分布及呈味機理的研究是十分必要的，其研究結果可為提高直投式發酵泡青菜的品質和風味提供數據參考，使其品質風味更接近于傳統的老壇泡青菜。

3 結論

本文分別以自然發酵、直投式乳酸菌發酵、老鹽水發酵制作泡青菜，并以感官評定、理化及微生物指標為參考比較了其品質的差異。直投式乳酸菌發酵泡青菜總酸上升快，可加快發酵速度，縮短發酵時間;其成品中亞硝酸鹽含量低，約為自然發酵泡青菜的1/5，老鹽水發酵泡菜的2/5。同時，接種乳酸菌占優勢，能抑制雜菌感染與生長，在一定程度上提高了產品的安全性;直投式發酵泡青菜成品酸度適中，色澤金黃，Vc含量相對較高，風味物質所含成分比自然發酵泡青菜種類多，與老鹽水發酵泡青菜相近，風味純正濃郁。

［1］ Choi I H，Noh J S，Han J S，et al.Kimchi，a fermented vegetable，improves serum lipid profiles in healthy young adults:randomized clinical trial［J］.Journal of Medicinal Food，2013，16(3):223-229.

［2］ 黃微薇.乳酸菌在發酵蔬菜中的綜合利用［J］.雞西大學學報，2010，10(4):59-60.

［3］ 陳靜.國內外泡菜生產的研究進展［J］.江蘇食品與發酵，2007(1):17-20.

［4］ Park K Y，Jeong J K，Lee Y E，et al.Health benefits of kimchi(Korean fermented vegetables)as a probiotic food［J］.Journal of Medicinal Food，2014，17(1):6-20.

［5］ Kwak S H，Cho Y M，Noh G M，et al.Cancer preventive potential of kimchi lactic acid bacteria(Weissella cibaria，Lactobacillus plantarum)［J］.Journal of Cancer Preven-tion，2014，19(4):253.

［6］ 唐雪鷺.直投式乳酸菌劑發酵泡菜的研究現狀及展望［J］.中國調味品，2012(12):1-4.

［7］ 王艷萍，郗宏波，姚四平，等.乳酸菌發酵芹菜泡菜的工藝研究［J］.中國釀造，2012，31(12):136-140.

［8］ 賀燕，秦丹，楊滔.泡菜直投式發酵劑研究進展［J］.農產品加工·學刊，2012(6):89-91.

［9］ 方義川，楊虹坤，何謙，等.直投式乳酸菌發酵劑的研制［J］.現代食品科技，2012，28(8):990-994.

［10］ 郝明玉.直投式發酵泡菜與自然發酵泡菜的比較研究［D］.南昌:南昌大學，2013.

［11］ 李文斌，宋敏麗，唐中偉，等.自然發酵泡菜微生物群落變化的研究［J］.中國食物與營養，2008(11):22-24.

［12］ 張艾青.產廣譜細菌素植物乳桿菌的初步研究及其在泡菜中應用［D］.雅安:四川農業大學，2007.

［13］ Dayun Z，Jian T，Xiao L D.Analysis of volatile components during potherb mustard(Brassica juncea，Coss.)pickle fermentation using SPME-GC-MS［J］.LWT-Food Science and Technology，2007，40(3):439-447.

［14］ 李文婷，車振明，雷激，等.乳酸菌制劑發酵泡菜品質及安全性研究［J］.西華大學學報，2011，30(3):97-99.

［15］ 余文華，張其圣，陳功，等.直投式菌劑發酵泡菜的動態研究［J］.食品與發酵工業，2010，36(6):12-15.

［16］ 閆征，王昌祿，顧曉波.pH值對乳酸菌生長和乳酸產量的影響［J］.食品與發酵工業，2003，29(6):35-38.

［17］ 楊瑞，張偉，徐小會.泡菜發酵過程中主要化學成分變化規律的研究［J］.食品工業科技，2005，26(2):95-98.

［18］ YU S M，ZHANG Y.Effects of lactic acid bacteria on nitrite degradation during pickle fermentation［J］.Advanced Materials Research，2013，781:1 656-1 660.

［19］ 夏巖石，孫春鳳.乳酸菌降解亞硝酸鹽的動態研究［J］.湖南科技學院學報，2008，29(8):44-46.

［20］ 張雪梅，曾順德，唐偲雨，等.不同乳酸菌株對蘿卜泡菜中亞硝酸鹽降解能力的研究［J］.西南農業學報，2014，27(1):450-452.

［21］ 呂兵，張國農.分離自傳統臘腸中的乳酸菌的特性研究［J］.食品與發酵工業，2004，30(8):64-67.

［22］ 段翰英，李遠志，蔣善有，等.泡菜的亞硝酸鹽積累問題研究［J］.食品研究與開發，2001，12(6):16-17.

［23］ 鄒華軍，李鳴，姜帆，等.傳統泡菜與乳酸菌發酵泡菜亞硝酸鹽和硝酸鹽含量動態變化分析［J］.營養與食品衛生，2013，40(20):3 733-3 734.

［24］ 李敏，賀云川.方便榨菜揮發性成分分析［J］.食品科技，2011，32(8):272-274.

［25］ 徐偉麗，趙國華，李洪軍，等.莖用芥菜芥子苷酶的特性研究［J］.中國食品學報，2006，6(2):41-45.