傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化*

孫霞，鞏洋，楊勇，曾建華，方秋艷，萬重，楊敏，卿丹丹，李躍文

(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)

生物胺(Biogenic amines，BA)是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有機化合物［1］。按組成成分的不同，可將生物胺分為單胺(組胺、酪胺、色胺、苯乙胺等)、二胺(尸胺、腐胺等)和多胺(精胺和亞精胺等)這三類［2］。適量的生物胺可以增強代謝活力、促進生長、增強腸道系統免疫活性、消除自由基和控制血壓等，并在神經系統中發揮活性作用［3］。過量的生物胺不僅會影響產品的風味，而且會對人體健康造成危害，導致高血壓、腹部痙攣和腹瀉等，引起人體心臟和中樞神經系統等器官的損害［4-5］。富含蛋白質的發酵肉制品、魚類和發酵豆制品由于易被微生物侵染而可能具有高濃度的生物胺［6-8］。目前應用于生物胺的檢測方法較多，主要包括高效液相色譜法、氣質聯用、薄層色譜法、毛細管電泳和生物傳感器法［9-11］。

傳統四川香腸主要利用自然發酵，發酵微生物來源于環境中混入的雜菌和肉中有益菌與雜菌競爭形成的優勢菌群［12］，這些微生物可能具有氨基酸脫羧酶活性，導致四川香腸中的氨基酸脫羧形成生物胺。De Mey等［13］研究發現，干發酵香腸中腐胺、尸胺和組胺的含量在保質期的時間內未超過FDA的標準。Gardini等［14］研究發現成熟120天的發酵香腸中酪胺、腐胺和尸胺的含量分別為165.55、22.87和52.90 mg/kg。目前對傳統自然發酵的四川香腸中生物胺的種類和含量的研究均較少。因此，測定傳統自然發酵的四川香腸加工過程中生物胺的含量具有十分重要的意義，本文以高效液相色譜法對其進行測定，期望為傳統自然發酵的四川香腸中生物胺的安全評估提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺的標準品以及衍生劑丹磺酰氯均購于美國Sigma公司;乙腈和丙酮為色譜純;高氯酸、氨水、NaOH、Na2CO3等均為分析純，購于成都化工試劑有限公司;超純水為實驗室自制。

ST16R高速冷凍離心機，北京博儀恒業科技發展有限公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒公司;BMS602型均質機，德國BRT公司;微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠;海爾冰箱;電子天平;高效液相色譜儀(島津 LC-2010CHT);超聲波清洗器(KH5200B型);超純水儀(Milli-Q，Millipore)。

1.2 傳統自然發酵四川香腸的制作

工藝配方:豬肉100 kg(皮下脂肪20 kg，瘦肉80 kg)，食鹽 2.5 kg，辣椒粉1.0 kg，花椒粉 0.4 kg，白砂糖1.0 kg，味精 0.15 kg，白酒 1.0 kg，十三香 0.05 kg，NaNO30.025 kg，NaNO20.007 5 kg。

工藝流程:原料肉→預處理→絞碎→添加配料→攪拌→腌制(4℃，4 h)→灌腸→自然晾掛(溫度為8～15℃，相對濕度為75% ～90%)→成品

1.3 實驗方法

1.3.1 生物胺標準溶液的配制

準確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺各50 mg，用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，在4℃冰箱避光保存。分別吸取各生物胺單組分標準儲備溶液，置于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L HClO4分別稀釋制成濃度分別為:0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL的混合標準溶液，在4℃冰箱避光保存。

1.3.2 生物胺標準品的衍生

參照胡鵬等［8］的方法，略作修改。取1 mL的標準品混合溶液，加入200 μL 2 mol/L NaOH使之呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖，加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液，在40℃下處于黑暗中反應45 min后加入100 μL的NH4OH終止反應，在室溫下暗反應30 min，去除殘留的丹磺酰氯溶液，加入乙腈使終體積為5mL。衍生處理后0.22 μm濾膜過濾，用于分析檢測。

1.3.3 樣品處理

取5 g香腸加入20 mL 0.4 mol/L HClO4，勻漿機上徹底勻漿，冷凍離心機(4℃，4 000 r/min)離心10 min，沉淀部分如前的方法再重新提取1次。取2次的上清液用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，取1 mL的樣液如標準溶液一樣進行柱前衍生。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速 1 mL/min，紫外檢測波長 254 nm，進樣量 10 μL，柱溫30℃，流動相A為水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 數據處理與統計分析

所有測定結果均為3次以上重復測定的平均值，使用Excel 2007和SPSS17.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 生物胺標品圖譜及標準曲線

圖1是生物胺混合標準樣品的色譜圖。由圖1可知，本實驗所采用的HPLC方法可將溶劑峰及雜質峰在前5 min內全部洗脫出。而7種生物胺:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺及亞精胺能在20 min內有效分離，采用該方法來分離生物胺具有較好的分離效果。從表2可以看出，7種生物胺的峰面積與其相應的濃度分別呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999，通過該方法可準確測定出生物胺的含量。

圖1 生物胺混合標品HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines

表2 七種生物胺回歸方程及相關系數Table 2 Regression equations and correlation coefficients of seven biogenic amines

2.2 傳統自然發酵四川香腸中生物胺含量

傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化見表3。原料肉中只檢測出了色胺、苯乙胺和亞精胺，這可能是由于原料肉中缺少了能夠產生氨基酸脫羧酶的微生物，導致生物胺的含量較少。有研究表明原料肉會影響生物胺的形成，Bover-Cid等［15］研究發現用經4℃、5天處理的原料肉做的發酵香腸中的生物胺比經-20℃、5天處理的原料肉形成更早且含量更高。亞精胺被認為是原料肉中常見的生物胺，Komprda等［16］發現亞精胺的含量不會受到發酵劑菌種和發酵時間以及發酵溫度的影響。

傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中檢測出的單胺有色胺、苯乙胺、組胺和酪胺，色胺是由色氨酸經過氨基酸脫羧作用形成的，其含量由原料肉的5.12 mg/kg增加到33.16 mg/kg，這與 Komprda等［17］研究發酵劑、貯藏時間和溫度對干發酵香腸中生物胺的含量影響的結果不一致，這可能是由于其在發酵前期較高的溫度導致蛋白質的降解，增加了色胺的積累。Suzzi［18］等發現發酵香腸中色胺含量低于30 mg/kg，傳統自然發酵四川香腸在加工貯藏前期也一直低于這個含量，但貯藏90 d后色胺超過30 mg/kg。苯乙胺由原料肉的1.77 mg/kg增加到22.12 mg/kg。有研究表明，發酵食品中苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可對人體構成潛在的危險，傳統自然發酵四川香腸在加工貯藏過程中一直低于30 mg/kg，說明苯乙胺含量在安全范圍之內。組胺由未檢出增加到127.90 mg/kg，組胺是生物胺中毒性最大的生物胺，美國食品藥品監督局規定了水產品中組胺含量不得超過50 mg/kg，上海市食品藥品監督管理局于2011年發布上海市地方標準《食品安全地方標準發酵發酵肉制品(征求意見稿)》，對比國內外相關標準，暫定發酵肉制品中組胺限量為低于200 mg/kg［19］，傳統自然發酵四川香腸在成熟前期(0～20 d)未超過50 mg/kg，在加工貯藏過程中未超過200 mg/kg。酪胺由未檢出增加到153.06 mg/kg，酪胺是毒性僅次于組胺，Latorre-Moratalla等［20］發現酪胺是歐洲傳統發酵香腸中含量最多的生物胺，酪胺含量最高達到773.43 mg/kg，有學者指出酪胺含量超過100 mg/kg會對人體健康造成不良影響［21］，傳統自然發酵四川香腸加工貯藏前期(0～70 d)未超過100 mg/kg。

腐胺和尸胺是傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中檢測出的二胺，腐胺由未檢出增加到92.83 mg/kg，尸胺由未檢出增加到132.46 mg/kg，腐胺和尸胺等二胺與其他胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)不同，它們本身的毒性較小，但是它們能抑制組胺、酪胺代謝酶和羥甲基轉換酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性;此外還可以與食物中的亞硝酸鹽反應產生致癌物質亞硝胺。腐胺在傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中未超過100 mg/kg，而尸胺在加工貯藏前期(0～70 d)未超過100 mg/kg。

亞精胺是傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中檢測出的多胺，且亞精胺的含量范圍在1.24～3.12 mg/kg，在整個加工貯藏過程中亞精胺的含量變化不顯著，這與Komprda等［17］的研究結果相似，即亞精胺的含量在加工貯藏過程中通常保持相對恒定，而與王桂瑛等［22］對火腿加工過程中生物胺的變化的研究結果不一致，這可能是由于香腸的加工工藝與火腿間存在差異。

在傳統自然發酵四川香腸貯藏120 d時，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺以及生物胺總量分別為:33.16、22.12、92.83、132.46、127.90、153.06、3.12 和 564.64 mg/kg。Eerola 等［23］認為，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)的總量低于20 mg/100 g是發酵肉制品具有較高品質的指標之一，傳統自然發酵四川香腸中血管活性生物胺含量均低于20 mg/100 g。在傳統自然發酵四川香腸整個加工貯藏過程中生物胺總量呈明顯增加的趨勢(P＜0.01)，Santos［24］認為生物胺總量超過1 000 mg/kg 會對人體健康產生極大威脅，傳統自然發酵四川香腸中生物胺總量遠低于1 000 mg/kg。

表3 傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量 單位:mg/kgTable 3 Content of biogenic amines in traditional natural fermentation Sichuan-style sausage during processing and storage

3 結論

在傳統自然發酵四川香腸加工貯藏過程中，原料肉中只檢測出了色胺、苯乙胺和亞精胺，貯藏120 d檢測出了7種生物胺，除亞精胺外，6種生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺)的含量在加工貯藏過程中均顯著增加(P＜0.01)。傳統自然發酵四川香腸中主要以酪胺、組胺、尸胺和腐胺為主，含量分別達到 153.06、127.90、132.46 和 92.83 mg/kg，4種生物胺占生物胺總量的89.66%。傳統自然發酵四川香腸中血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺和酪胺)含量均低于20 mg/100 g。生物胺總量在加工貯藏過程中變化顯著(P＜0.01)，總量低于1 000 mg/kg。有學者建議發酵香腸中各種生物胺含量應低于100 mg/kg，傳統自然發酵四川香腸在加工貯藏前期(0～70 d)各種生物胺含量均低于100 mg/kg，在貯藏后期(70～120 d)尸胺、組胺和酪胺的含量超過100 mg/kg，因此為保障傳統自然發酵四川香腸的安全，需對其貯藏后期生物胺的控制進行進一步研究。

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