鯖魚加工廢棄物分段發酵過程中生化指標的動態變化

劉書來，柯玉原，周緒霞，丁玉庭

(浙江工業大學海洋學院，浙江杭州，310014)

近年來隨著我國海底層經濟魚類資源的衰退，使鯖魚等中上層魚類資源越顯豐富，其年產量維持在40多萬t，從而成為我國東海區海洋漁業中具有重要地位的魚獲物之一。鯖魚可被加工成魚脯、魚糜、魚罐頭等產品，但是生產過程中會產生40% ～60%的加工廢棄物［1］。目前對魚類加工廢棄物的利用方式有很多，比如:將魚皮處理成皮革［2］;將魚鱗做成天然吸附劑;分離酶、明膠和具有抗微生物和抗腫瘤能力的蛋白質［3］;通過生物煉制方法生產生物燃料以及其他各種大容量化工原料及產品［4］;在魚廢棄物中添加植物乳桿菌進行發酵［5］或添加其他乳酸菌生產動物飼料產品［6-7］;也有研究者在回收的魚廢物中接種乳酸菌和酵母混合物，測試乳酸菌和酵母菌在魚廢棄物中的活性，并獲得互補的成分形成了均衡的食物配給動物食用［8］。

因植物乳桿菌是厭氧細菌(兼性好氧)，活菌數比較高，能大量產酸，能有效控制發酵液的pH環境抑制腐敗性微生物和堿性物質的產生。產朊假絲酵母是高蛋白源，其可優化廢棄物的蛋白組成，并已用于生產幾種工業產品［9］。本試驗先在鯖魚廢棄物中添加葡萄糖、植物乳桿菌進行發酵，降低發酵環境的pH，到一定程度后再添加產朊假絲酵母，并考察短時連續分段發酵過程中鯖魚加工廢棄物的生化指標動態變化。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

1.1.1 原料

原料為鯖魚罐頭產品加工后的廢棄物，由臺州興旺水產有限公司提供。

1.1.2 菌種

產朊假絲酵母Y150(Candida utilis)和植物乳桿菌B758(Lactobbacillus phan)，上海市工業微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

NaOH、HClO4、HCl、甲醛、山梨酸、Na2SO3、CuSO4·5H2O、NaKC4H4O6·4H2O、H3BO3、C2HO2Cl3等均為分析純。

1.2.2 主要儀器

PHS-3C型數顯酸度計，上海精密科學儀器有限公司;AR2130電子精密天平，華東醫藥有限公司;HR2860型打漿機，上海飛利浦有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀，海能儀器;UV-7504型紫外可見光分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;LRH-250F型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司;TCL-16M型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;SKY-111B型低溫恒溫振蕩搖床，上海蘇坤實業有限公司。

1.3 發酵劑制備

將植物乳桿菌接入 MRS肉湯培養基中，于30℃、180 r/min搖床培養，然后離心(8 000r/min，10 min)后，用0.85% 生理鹽水沖洗并調整至植物乳桿菌濃度約為12 g/L。

將產朊假絲酵母接入WORT肉湯培養基中，于30℃、180 r/min搖床培養，然后離心(5 000 r/min，10 min)后，用0.85%生理鹽水沖洗并調整至產朊假絲酵母濃度約為19 g/L。

1.4 發酵過程

將鯖魚加工廢棄物切碎，采用打漿機打碎后剁碎成魚糜狀，稱量60 g于250 mL三角瓶中，添加20 mL水，巴氏殺菌(75℃，20 min)，并添加已單獨滅菌的0.2 g/mL葡萄糖溶液7.2 mL，作為發酵培養基。

采用分段發酵方式，先在發酵培養基中接種5%(v/w)植物乳桿菌于30℃下厭氧發酵6 h，再接種5%(v/w)產朊假絲酵母并分別在25、30、35℃下好氧發酵42 h。

1.5 分析方法

1.5.1 微生物平板計數

參考GB 4789.2-2010無菌操作方式。植物乳桿菌采用MRS瓊脂培養基，并加入2 g/L山梨酸以抑制產朊假絲酵母生長，在37℃培養(72±3)h后計數;產朊假絲酵母采用麥芽汁瓊脂培養基，在28℃下培養(72±3)h后計數。

1.5.2 pH值測定

參照GB/T 5009.45-2003。

1.5.3 總酸、氨基態氮含量測定

總酸參照GB/T 12456-2008測定，氨基態氮含量測定是在測定總酸后的樣品中加入10 mL 36%～38%的甲醛溶液，用0.05 mol/L NaOH滴定至pH 9.2。

1.5.4 水溶性蛋白質含量測定［10］

采用雙縮脲法，標準曲線方程為y=0.529 4x+0.007 6，R2=0.999 2。

1.5.5 揮發性鹽基氮含量測定

參照SC/T 3032—2007。

1.5.6 非蛋白氮含量測定［11］

本試驗稱取樣品約5.000 g于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水靜置30 min，然后加入10 mL 10% 三氯乙酸溶液靜置30 min，濾紙過濾，殘渣用三氯乙酸溶液沖洗2次，凱氏定氮儀定氮。

1.5.7 統計分析

數據分析采用SPSS 21和Excel 2007軟件，數據均以平均值±SD表示，采用最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性分析，顯著性水平設置為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 微生物變化

表1為鯖魚加工廢棄物發酵過程中植物乳桿菌和產朊假絲酵母的生物量隨發酵時間的變化情況。厭氧發酵階段中植物乳桿菌在厭氧和葡萄糖存在的條件下快速生長繁殖，由初始7.83 lg(CFU/g)快速上升至8.61 lg(CFU/g)。6 h后開始進入好氧發酵階段，在25、30和35℃下，因植物乳桿菌是兼性厭氧菌，仍能繼續生長繁殖，至發酵結束時分別達到8.98、9.11、8.77 lg(CFU/g);產朊假絲酵母在 25 和30℃下，快速生長繁殖，至發酵結束時分別達到6.52、6.64 lg(CFU/g)，但在35℃，產朊假絲酵母生物量在6～30 h之間上升，30～48 h之間下降，至發酵結束時為5.3 lg(CFU/g)。30 h后產朊假絲酵母生物量顯著小于其他兩個溫度下的產朊假絲酵母生物量(P＜0.05)。主要原因是35℃過高，不利于產朊假絲酵母生長繁殖。從發酵結果可以看出，本試驗中3個發酵溫度對植物乳桿菌生長繁殖影響差異不大，而25和30℃下，產朊假絲酵母生物量有所增加，提高了發酵基質中單細胞蛋白含量。另外，植物乳桿菌和產朊假絲酵母可以共同生長是因為乳酸菌與酵母菌之間存在代謝產物互補機制［12］，酵母菌在發酵過程中為乳酸菌提供了許多營養因子例如氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等其他物質［13］，而乳酸菌的代謝產物又為酵母菌提供了能量來源［14］。

表1 分段發酵過程中植物乳桿菌及產朊假絲酵母的生物量變化Tabel 1 Biomass changes of L.phan and C.utilis in segmented fermentation process

2.2 pH和總酸的變化

圖1為鯖魚加工廢棄物發酵過程中pH和總酸含量的變化。第1發酵階段中pH快速下降，從初始6.48降至5.46。第2發酵階段中pH在6～12 h繼續下降至4.80左右，而12～48 h，pH變化趨于平緩，至發酵結束時略有上升。pH的變化趨勢與Hernan等［6］在魚廢棄物中添加植物乳桿菌制備魚青貯飼料的結果一致。pH快速下降可能是由于植物乳桿菌在厭氧發酵條件下急速生長和繁殖產生大量有機酸引起的。而pH在發酵后期趨于平緩且略有上升，一方面可能與產朊假絲酵母生長繁殖過程中利用了植物乳桿菌產生的乳酸有關［15］;另一方面可能是發酵液的酸性環境使蛋白質發生降解，產生一些堿性含氮物質，或者是原料中的腐敗菌生長繁殖產生胺類物質，中和酸性物質所致［16］。25、30和35℃三個發酵溫度之間的pH相差不大，總酸含量也無顯著性差異(P＞0.05)，總酸含量變化趨勢與pH呈負相關。

圖1 分段發酵過程中pH和總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid in segmented fermentation process

2.3 水溶性蛋白質含量變化

圖2為鯖魚加工廢棄物發酵過程中水溶性蛋白含量的變化情況。第1發酵階段中水溶性蛋白質含量在0～6 h略有上升。第2發酵階段中水溶性蛋白質含量在25、30和35℃三個不同溫度條件下均逐漸下降，至發酵結束時分別為0.74、0.98和0.63 g/100 g。一方面可能是較低的pH發酵環境改變了鯖魚廢棄物蛋白質結構引起的［17］;另一方面可能是菌種本身產生的蛋白酶使蛋白質降解［16］引起的。由圖2可知，35℃下水溶性蛋白質含量下降速率比25和30℃下水溶性蛋白質含量下降速率快，但是35℃下產朊假絲酵母菌生物量低于其他兩組，可推測植物乳桿菌和產朊假絲酵母產的蛋白酶不是影響水溶性蛋白質含量下降的主要原因，而35℃下的pH低于其他兩組，可推測酸性環境是水溶性蛋白質降解的主要原因。

圖2 分段發酵過程中水溶性蛋白質含量的變化Fig.2 Changes of water-soluble protein in segmented fermentation process

2.4 氨基態氮含量變化

氨基態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。由圖3可知，第1發酵階段中，氨基態氮含量在0～6 h逐漸上升，從初始0.28 g/100 g上升至0.30 g/100 g。第2發酵階段中氨基態氮含量在25、30和35℃三個不同溫度條件下均逐漸上升，至發酵結束時分別為0.31、0.43和0.36 g/100 g。氨基態氮含量變化與水溶性蛋白含量變化總體呈負相關，也是由于蛋白質降解形成氨基酸引起的。雖然在6～48 h，30℃下氨基態氮含量較高，但是25、30和35℃三個發酵溫度下的氨基態氮含量均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 分段發酵過程中氨基態氮含量的變化Fig.3 Changes of amino nitrogen in segmented fermentation process

2.5 揮發性鹽基氮含量變化

揮發性鹽基氮(TVB-N)是用于評價揮發性胺類物質形成的重要指標，并可表征發酵過程中腐敗微生物及其代謝形成腐敗性物質的變化規律。由圖4可知，第1發酵階段中，TVB-N含量在0～6 h略有下降，從初始62.26 mg/100 g下降至60.99 mg/100 g。第2發酵階段中TVB-N含量在25、30和35℃下均先快速下降，接著趨于平緩，最后逐漸上升，至發酵結束時分別為48.59、53.97和55.69 mg/100 g。并且25℃下TVB-N含量顯著低于30和35℃下TVB-N含量 (P ＜0.05)。Hu Yongjin等［18］認為，TVB-N 含量下降是因為乳酸菌產生的乳酸和抗菌素中和了TVB-N引起的。而M.H.EI Jalil等認為，TVB-N含量高低與蛋白質降解有關［19］，TVB-N含量在發酵后期逐漸上升可能是由于腐敗微生物與酶使含氮化合物如蛋白質、肽、氨基酸等發生脫氨基或者分解反應，并使之轉化為氨基酸和揮發性氮［20］。

圖4 分段發酵過程中揮發性鹽基氮含量的變化Fig.4 Changes of total volatile base nitrogen in segmented fermentation process

2.6 非蛋白氮含量變化

非蛋白氮(NPN)在飼料加工領域是飼料中蛋白質以外的含氮化合物的總稱，包括游離氨基酸、蛋白質降解的含氮化合物、氨以及銨鹽等簡單含氮化合物。由圖5可知，第1發酵階段中，NPN含量在0～6 h逐漸上升，從8.8 mg/g上升至9.06 mg/g。第2發酵階段中，NPN含量在25、30和35℃三個不同溫度下均逐漸上升，至發酵結束時分別為11.15、11.36和11.90 mg/g。NPN含量的變化趨勢與AHammoumi等［5］在魚廢棄物中添加植物乳桿菌后用于飼養肉仔雞的研究中的變化趨勢一致。NPN的變化趨勢可能是一些微生物或內源性酶將蛋白氮轉化成NPN引起的［5］;也可能是較低的pH值使蛋白質結構改變，促進NPN含量增加［21］。雖然35℃下NPN含量最高，至發酵結束時達到11.90 mg/g，但是25、30和35℃三個不同發酵溫度對非蛋白氮含量影響差異不大。

圖5 分段發酵過程中非蛋白氮含量的變化Fig.5 Changes of non-protein nitrogen in segmented fermentation process

3 結論

本研究以鯖魚加工廢棄物為發酵原料，以植物乳桿菌和產朊假絲酵母為發酵劑，探索提高鯖魚加工廢棄物高值化利用的途徑。發酵結束時，水溶性蛋白質含量降低，非蛋白氮含量上升，氨基態氮含量由初始0.28 g/100 g分別提高至0.31、0.43和0.36 g/100 g，表明發酵劑一定程度上利用鯖魚加工廢棄物中蛋白質，提高了發酵基質中的多肽和氨基酸含量;pH變化與TVB-N變化呈正相關，TVB-N含量從初始62.26 mg/100 g分別降低至48.59、53.97和55.69 mg/100 g，表明添加植物乳桿菌能夠充分抑制腐敗微生物生長繁殖，保證發酵環境的安全性，同時為產朊假絲酵母生長繁殖提供有利條件;溫度變化對植物乳桿菌生長繁殖影響不大，其生物量均有所提高，從初始7.83 lg(CFU/g)分別上升至8.98、9.11 和8.77 lg(CFU/g);產朊假絲酵母生物量從初始5.62 lg(CFU/g)分別上升至6.52、6.64 lg(CFU/g)和下降至5.30 lg(CFU/g)，表明25和30℃下利于產朊假絲酵母生長繁殖，發酵基質中單細胞蛋白含量會增加，這也提高了鯖魚加工廢棄物的營養價值，而35℃下不利于產朊假絲酵母的生長繁殖。

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