5株酵母菌的系統發育樹分析以及發酵性能測定

蔣 麗，董 丹，邢亞閣，車振明*，羅建峰

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

5株酵母菌的系統發育樹分析以及發酵性能測定

蔣 麗1，董 丹1，邢亞閣1，車振明1*，羅建峰2

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

從四川藏區高原威代爾冰葡萄渣泥中分離純化出5株酵母，用18S rDNAD1/D2區域序列，通過序列比對及構建系統發育樹分析，通過WL培養基的培養觀察和普通光學顯微鏡觀察，并且進一步對5種酵母菌的發酵性能進行測定。結果表明：JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。該5種酵母菌均有一定的發酵能力，并且發酵液總酚、還原糖、果糖以及總酸含量等均有不同變化?？傮w來說，JH2的發酵性能最好。

酵母菌；分離鑒定；發酵性能；系統發育樹

酵母菌是葡萄酒釀造的主要微生物，酵母菌是發酵過程的主導，不同的酵母可以賦予葡萄酒不同給感官風味[1]。近年來人們開始重視眾多天然酵母在原產地葡萄酒生產中的重要貢獻，積極開發原生態天然菌群的耦合，實現多菌株組合發酵，充分凸現天然酵母的優良特性，釀造味感豐富、香氣濃郁、風格獨具的產地葡萄酒[2]。釀酒酵母屬的發酵特性因菌株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導致利用的底物不同、生成的化學物質不同，從而使發酵產物的風味物質存在差異，賦予產品獨特的風味[3]。川西高原藏區阿壩州理縣以其特殊的氣候條件，開發研制了威代爾等系列冰葡萄酒，不僅酒體口感好，味道獨特，而且很受當地人的喜歡[4]。在冰葡萄酒生產中，由于影響葡萄酒品質的關鍵因素是其中的發酵微生物，而酵母菌作為主要的發酵微生物不僅對葡萄酒產量、質量和發酵生產管理影響很大，而且對葡萄酒特色和風格的形成也至關重要。所以為了找出更適合釀造冰葡萄酒的酵母菌，要求了解掌握酵母菌的一系列發酵性能。

隨著應用于酵母菌分類的快速鑒定系統不斷面市，Biolog系統以其數據庫大、鑒定范圍廣，鑒定快速等優點，目前已經成為國際上酵母菌多相分類鑒定常用的技術手段[5-6]。已有文獻表明，Biolog系統對于釀酒酵母的鑒定具有好的效果，鑒定結果可達100%，在KUTTZMANC P等[7]提及到的所定的同種內不同菌株間的差異不超過1%的標準。利用基因測序通過對威代爾葡萄汁發酵過程中的酵母菌JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌種進行了系統發育樹分析，并進一步研究了5株菌株的發酵性能，為川西藏區冰葡萄酒擴大生產及品質控制提供了一定的技術支持，對川西高原冰葡萄酒行業的發展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍泉巨峰葡萄：西華大學紅光鎮。

1.1.1 菌種來源

從四川藏區高原威代爾冰葡萄渣泥中分離出5株酵母菌，分別編號為JH、JH1、JH2、JH3和JH4。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、基準鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、果糖等其他試劑均為分析純：成都科龍化工廠。

1.1.3 培養基

WL營養瓊脂培養基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%，將上述成分配好后加熱溶解，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋DHP-9052型電熱恒溫培養箱：上海益恒實驗儀器公司；721分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHB-B型恒溫振蕩箱：金壇市富華儀器有限公司；pHS-25精密pH計：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的形態學觀察

菌落形態特征：將篩選菌株接種與YPD液體培養基和WL固體平板上，29℃培養3 d，分別觀察固體菌落和液體菌落形態特征，液體菌落形態觀察以不加菌液為參比對象。

細胞形態特征：用接種環挑取少許WL平板上培養48 h的菌株，滴加1滴1%美蘭染色液染色后，在顯微鏡下觀察細胞形態特征。

1.3.2 酵母菌的發酵性能實驗

采用新鮮成熟的龍泉巨峰葡萄，運至實驗室后破碎，調節pH值為3.6，二氧化硫含量為60 mg/kg，將5株酵母菌活化后，按0.6%的接種量分別接種與裝有500 m L新鮮葡萄漿發酵罐中，15℃恒溫發酵。測定指標有總酸、還原糖、果糖、總酚含量，同時以不添加任何酵母菌的葡萄汁作為對照實驗。

1.3.3 總酚含量的測定[8]

正常發酵生產的葡萄酒中富含多酚類化合物。試樣中的多酚化合物在堿性條件下，與福林酚試劑形成藍色物質，在波長765 nm處測定吸光度值，可通過測定其吸光度值計算總酚的含量。

1.3.4 還原糖含量的測定

采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法。

1.3.5 總酸含量的測定

采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中電位滴定法，利用酸堿中和原理，用氫氧化鈉標準溶液直接滴定樣品中的有機酸，以pH=8.2為電位滴定終點，根據消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，計算試樣中的總酸含量。

1.3.6 果糖含量的測定

采用分光光度法測定發酵液中果糖的含量[9]。

1.3.7 ITS序列擴增、測序以及系統發育樹構建

對分離出的5株酵母菌進行總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取、基因間隔序列（internal transcript space，ITS）序列擴增以及測序[10-12]，然后用核酸序列數據庫GenBank中進行同源序列搜索，用Blast軟件進行同源性比較，采用MEGA5.2軟件進行ITS同源性分析，繪制系統發育樹。

對于酵母菌株JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別下載酵母屬13、11、15、17和15個相關菌種模式株的18S rDNA D1/D2區序列采用同樣方法進行序列分析和系統發育樹分析。

采用18S rDNA序列分析法對分離出的菌株進行分子鑒定。采用玻璃珠法[14]提取基因組總DNA：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系為30 μL重蒸水，5 μL 10×PCR擴增緩沖液（Mg2+Free），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4μL三磷酸脫氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L），正向引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）各1 μL，1 μL Tap聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。

PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，經30個循環后最終72℃保持10 m in，然后等溫度降至4℃停止運行。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的形態學觀察

2.1.1 菌落形態特征

各菌株在WL培養基上涂布培養3 d后，JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的單菌落形態特征結果如圖1所示。

由圖1可知，單菌落的形態特征各不相同。JH菌落呈深綠色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH1菌落呈棕色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH2菌落呈奶油色帶淡綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH3菌落呈淡藍色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH4菌落呈乳白色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。

圖1 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株固體培養菌落特征Fig.1 Colonial characteristics of cultured JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 on solid agar medium

2.1.2 細胞形態特征

JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的細胞形態特征見圖2。

圖2 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株單體出芽生殖形態Fig.2 Morphology of individual spores germ ination o f JH,JH1, JH2,JH3 and JH4

由圖2可知，5種酵母菌細胞都呈卵圓形或球形，菌株的生長方式為出芽生殖。

2.2 PCR擴增目的基因的結果

標準品基因和目的基因擴增電泳結果見圖3。由圖3電泳結果可知，對樣本的18S rDNA基因進行PCR擴增，所擴增片段的大小約為1.8 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達到了對酵母的18S rDNA基因的PCR擴增目的。通過基因測序，采用BLAST和ClustalX程序與GenBank中以收錄的酵母18S rDNA D1/D2區序列比對，鑒定出JH、JH1、JH2、JH3、JH4五種菌株分別為有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖3 目的基因擴增電泳圖(瓊脂糖1%)Fig.3 PCR amplification electrophoretogram of target gene (agarose 1%)

2.3 實驗菌株JH的序列分析和系統發育樹的構建

ITS區域核酸序列的相似性已經成為確定酵母菌分類地位的重要分子生物學依據[14]，根據菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4的ITS測序結果進行Blast分析，以18S rDNA序列同源性為基礎構建系統發育樹，結果見圖4。

圖4 菌株JH(a)、JH1(b)、JH2(c)、JH3(d)和JH4(e)18S rDNA D1/D2基因序列NJ系統發育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from 18S rDNA gene D1/D2 sequence of JH(a),JH1(b), JH2(c),JH3(d)and JH4(e)

由圖4可知，菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4與GenBank中其他一些參考酵母菌株的親緣關系。其中菌株JH與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）有較高相似性，相似度達99%以上，與其親緣關系最近，故鑒定菌株菌株JH為萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。其中菌株JH1與美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）有較高相似性，相似度達99%以上，與其親緣關系最近，故鑒定菌株菌株JH1為美極梅奇酵母（Metschikowia pulcherrima）。菌株JH2與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關系最近，故鑒定菌株菌株JH2為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株JH3與解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關系最近，故鑒定菌株菌株JH3為解脂耶羅維亞酵母（Yarrawia lipolytica）。其中菌株JH4與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關系最近，故鑒定菌株菌株JH4為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖5 葡萄酒發酵期間總酚含量的變化Fig.5 Change of total phenols content during wine fermentation

2.4 總酚含量測定結果

由圖5可知，這五種發酵液中的總酚含量都隨著發酵時間的延長呈下降趨勢，速度較快，這有可能是因為發酵過程中酵母釋放次級代謝產物如丙酮酸、乙醛等到發酵液中，與多酚類的物質發生反應生成一些大分子衍生物；此外，微生物產生的酶也會使其發生降解，導致水溶性不斷下降而沉淀下來[15]。添加JH1酵母的發酵液中的總酚含量下降得最快，從最初含量462.86 mg/L下降至112.86 mg/L，然而對于未添加酵母的發酵液中總酚含量變化趨勢是先快后慢，尤其是在前6 d，從496.79 mg/L下降至327.14 mg/L，在后期，總酚含量下降趨于平緩，是所有發酵液中減慢速度最緩慢。結果表明，在發酵后期，發酵液中總酚含量比較：添加JH1酵母的發酵液＜添加JH3酵母的發酵液＜添加JH4酵母的發酵液＜添加JH酵母的發酵液＜添加JH2酵母的發酵液＜未添加任何酵母的發酵液。

2.5 果糖含量測定結果

圖6 葡萄酒發酵期間果糖含量的變化Fig.6 Change of fructose content during wine fermentation

由圖6可知，在發酵葡萄汁初期，果糖最的含量達到1 751 μg/L，6種發酵液的果糖含量隨著發酵天數的增加逐漸減少，在發酵初期（0～6 d），果糖含量減慢的速度最快，在6～17 d內，6種發酵液果糖含量下降緩慢，在發酵后期（17～23 d），其果糖含量基本保持平穩，變化不大。從酵母菌發酵性能的差異性來分析，在發酵6d內，添加JH和JH2酵母菌的發酵液在發酵中期果糖量最大，說明對果糖的利用率比較高，JH和JH2的果糖含量分別從1 685 μg/L下降至528.2 μg/L、416.11 μg/L，都比不添加酵母菌的發酵液減慢得快；但添加JH1酵母菌的發酵液消耗果糖量都比未添加酵母菌的發酵液小。從6 d到發酵結束，未添加JH酵母的發酵液消耗的果糖量比其他5種方式消耗的果糖量多，然而，添加酵母菌JH1、JH2、JH3和JH4酵母菌的發酵液中消耗果糖含量比未添加酵母菌消耗的果糖量少，這是可能添加的酵母菌有可能會抑制其他酵母菌的生長，使果糖的利用率降低。但在發酵后期，所有發酵液中的果糖含量降低速率基本一致即趨于平緩，這可能因為在發酵后期酒精含量增加，抑制酵母菌的生長；或是在發酵后期酵母菌數量減少也會使糖的利用率降低。

圖7 葡萄酒發酵期間總酸含量的變化Fig.7 Change of total acid content during wine fermentation

2.6 總酸含量測定結果

葡萄酒中的酸類物質可以平衡酒體。適量的酸含量能在口感上平衡酒體里的酒精和甜度，讓葡萄酒甜而不膩，增強葡萄鮮果的水果風味，增加味覺的舒適性[16]不同葡萄汁發酵過程中，不同酵母菌在相同溫度下總酸含量變化如圖7所示。由圖7可知，在0～6 d內，添加JH、JH1、JH3和JH4菌的發酵液中的總酸含量在降低，而JH2和為添加酵母菌的發酵液總酸含量在0～5 d降低；隨著時間的增加，6種發酵液的總酸含量都平緩增加。根據池成[17]報道醋酸菌會導致葡萄酒中醋酸等揮發酸含量顯著升高，使葡萄酒產生特殊的令人不愉快的酸苦味，所以在葡萄酒釀造中合理控制發酵過程中總酸的產生是釀造葡萄酒的重要工藝流程之一。當發酵到最后各發酵液中總酸含量的比較：JH1＞JH2＞JH＞JH4＞原液＞JH3，說明JH菌產生的總酸最多，其次是JH2、JH、JH4和未添加酵母菌，產生總酸最少是添加JH3菌的酵母菌。

2.7 還原糖含量測定結果

圖8 葡萄酒發酵期間還原糖含量的變化Fig.8 Change of reducing sugar content during wine fermentation

由圖8可知，6種發酵液的糖度隨著發酵天數的增加逐漸減少，在發酵初期（0～9 d），還原糖減慢的速度較緩慢，在9～12 d內，6種發酵液還原糖含量急劇下降，在發酵后期，其還原糖含量平穩下降，變化不大。從酵母菌發酵性能的差異性來分析，添加JH和JH3酵母菌的發酵液在發酵中期消耗糖量最大，JH和JH3的還原糖含量分別從120.87 g/L、115.29 g/L變成47.56 g/L、42.22 g/L，都比不添加酵母菌的發酵液減慢得快；但添加JH1、JH2和JH4酵母菌的發酵液在發酵中期消耗糖量都比未添加酵母菌的發酵液小；尤其是添加JH1酵母菌的發酵液還原糖降低的含量最小。這是可能添加的酵母菌有可能會抑制其他酵母菌的生長，使糖的利用率降低。在發酵后期，所有發酵液中的還原糖含量降低速率基本一致即趨于平緩。這是可能因為在發酵后期酒精含量增加，會抑制酵母菌的生長；或是在發酵后期酵母菌數量減少也會使糖的利用率降低。

3 結論

本研究從四川藏區高原威代爾冰葡萄果實中分離純化并鑒定出的菌株。系統進化樹分析結果表明，該菌株與GenBank中相關標準菌株的18S rDNA D1/D2區序列構建的系統發育進化樹顯示，這五種菌株分別與Hanseniaspora uvarum、Metschnikowia pulcherrima、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica和Wickerhamomyces anomalus處在同一分枝。根據酵母菌株同一個種的不同菌株18S rDNA D1/D2區核酸替換率不超過1%，因此將該五種菌株分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母和異常威克漢姆酵母。

通過對這五種酵母菌發酵性能實驗分析，該5種酵母菌均有一定的發酵能力，發酵液中總酚含量、還原糖含量、果糖含量以及總酸含量隨著發酵時間的延長而改變，并且添加葡萄汁有孢漢遜酵母的發酵液消耗的果糖多，消耗果糖最少的是添加解脂耶羅維亞酵母的發酵液；發酵液中總酸含量變化最大的是添加美極梅奇酵母，變化最小的是添加解脂耶羅維亞酵母；發酵液中添加解脂耶羅維亞酵母消耗的還原糖最多；添加JH1酵母的發酵液中的總酚含量下降最慢，不添加酵母的發酵液總酚含量下降最快。總體來說，菌株JH2發酵性能最好。

此研究對篩選川西冰葡萄酒產區特色酵母菌，并構建出冰葡萄酒發酵微生物資源庫具有一定意義，并且為川西藏區冰葡萄酒標準化生產提供技術支持。

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Phylogenetic analysis and fermentation properties of five yeast strains

JIANG Li1,DONG Dan1,X ING Yage1,CHE Zhenming1*,LUO Jianfeng2
(1.Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasijiuzhuang Co.,Ltd.,Ngawa Prefecture 623100,China)

Five strains of yeast were isolated from the Sichuan Tibetan Plateau Vidal Ice grape slag mud and identified using 18S rDNAD1/D2,after sequences analysis and phylogenetic tree construction and analysis.The yeasts were cultured by WL medium and observed by ordinary optical microscope,and further fermenting property of five strains of yeast were determined.Results showed that JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 were identified as Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrima,Saccharomyces cerevisia,Yarrowia lipolytica,Wickerhamomyces anomalus,respectively.The five kinds of yeasts had certain fermenting property.The changes of total phenol,reducing sugar,fructose and total acidin fermentation broth were different.In conclusion,JH2 had the optimal fermenting property.

yeasts;isolation and identification;fermenting property;phylogenetic analysis

TS261.1

A

0254-5071（2015）03-0048-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.011

2015-01-19

省科技支撐計劃項目（2011SZ0284，2012SZ0117，13KCBZ0066）；2012年西華大學食品生物技術重點實驗室開放研究基金資助項目（SZjj2012-005）；2013年西華大學研究生創新基金項目（ycjj201346）

蔣麗（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向為食品發酵技術。