一株耐酒精纖維素酶產生菌的篩選、鑒定及其特性研究

黃 河，林元山，周 熠，饒力群，盧向陽

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

一株耐酒精纖維素酶產生菌的篩選、鑒定及其特性研究

黃 河，林元山，周 熠，饒力群，盧向陽*

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

利用乙醇-CMC-Na平板初篩，經搖瓶發酵復篩，從谷酒成熟酒醪中篩選獲得1株耐酒精纖維素酶活力較高的細菌Lys-1249。經生理生化測定、形態觀察及16S rDNA基因序列的同源性分析，將其鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。經正交試驗優化該菌株的產酶條件，表明該菌株在麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培養基初始pH值為7.0，培養溫度37℃，發酵周期48 h的條件下，其耐酒精纖維素酶活力達到158.54 U/mL。該菌株在6.0%vol乙醇培養基中生長良好，活性可保持65.95%。

纖維素酶；篩選；鑒定；酒精；發酵

纖維素是由類似于多個葡萄糖分子組成的大分子多糖，為植物細胞壁的主要成分，屬于地球上最豐富的可再生資源[1]。纖維素酶是指能降解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協同作用的多組分酶系。纖維素酶的生產菌株有細菌、放線菌和絲狀真菌[2]。研究較多的是木霉屬的酸性纖維素酶，如綠色木霉的纖維素酶，因其纖維素酶酶系完全，活性較高，已成為目前主要的商業化纖維素酶[2]。近年來，纖維素酶、半纖維素酶的產量增加迅速，廣泛用于紡織、食品、飲料、釀酒、造紙工業以及醫療行業[3-4]。目前由于化石燃料的逐年減少，國內外學者著力于探索纖維質生產燃料酒精這一新途徑；該方法有兩步法和共發酵法[5]。但研究結果與淀粉質原料生產酒精的水平相差較大，菌株纖維素酶活力較低、耐酒精度低或耐酸耐堿的能力弱等原因使其難以實現纖維素工業化處理[6]。本試驗對耐酒精纖維素酶及其產生菌作了探索，為纖維素原料直接通過共同發酵法生產酒精提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篩選土壤樣品采集來源于從岳麓山、長沙縣榔梨鎮谷酒坊成熟酒醪等地。

羧甲基纖維素鈉鹽（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）、氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；剛果紅：中國遠航試劑廠；硫酸銨（分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司；麩皮、黃豆粉、空谷殼等原料購于當地市場。

篩選培養基：無水乙醇10.0%（滅菌冷卻后加入），CMC-Na 1.0%，（NH4）2SO41.0%，KNO30.5%，Na2CO30.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

斜面及計數培養基：蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，麩皮（40目）0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121℃滅菌20 m in。

發酵培養基：麩皮2.0%，蛋白胨0.5%，CMC-Na 0.5% pH 7.0，121℃滅菌20 min。

酒精耐受液體培養基：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 m in。冷卻后再加入無水乙醇至相應的含量（0～10.0%vol）。

1.2 儀器與設備

M J-106C霉菌培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HH-60數顯恒溫攪拌循環水箱：常州市華普達教學儀器有限公司；QYC2112立式恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；V-5000型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；TOMY ES-315高壓蒸汽滅菌鍋、KF-3102電子天平：浙江凱豐集團有限公司；ZWL-08B臺式低速離心機：常州市華普達教學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

篩選培養基經滅菌冷卻至約60℃時，加入體積分數為10.0%的無水乙醇，混勻迅速倒平板。所取菌株材料按10倍稀釋法稀釋，取適當稀釋度的菌懸液涂布于篩選培養基平板，37℃恒溫培養2～3 d。待單菌落長出，用5.0 m L 0.5%無菌剛果紅染色浸泡篩選平板10 min，然后傾棄染色液，再用5.0 m L 1.0 mol/L的無菌NaCl洗滌脫色10～20 min，期間更換洗滌脫色液2～3次，觀察并測量菌落和水解圈直徑大小，選取水解圈和菌落比值較大菌落接種斜面，編號，置于4.0℃冰箱保存備用。

1.3.2 菌株的搖瓶發酵復篩

將初篩菌株接種于250 m L三角瓶（培養基100 m L），200 r/m in、37℃培養48 h，發酵液用4層紗布過濾，濾液在10 000×g條件下離心20 m in，上清即為粗酶液，用于酶活力測定。纖維素酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[7-8]，并作適當修改：取適當稀釋初酶液0.5 m L，加入乙醇5.0%vol-CMC-Na 1.0%的底物溶液1.5 m L，對照管酶液預先在100℃條件下煮沸10 m in滅酶活，在50℃水浴中反應30 min。再加入2.0 m L DNS試劑，煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，定容至20 m L，于波長540 nm處測光吸收值。以每分鐘由CMC-Na產生1.0 μg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量定義為一個活力單位（U/m L）。

1.3.3 菌株的搖瓶發酵條件優化

根據搖瓶單因素發酵試驗結果，選取麩皮、蛋白胨、溫度、pH值4個因素，進行4因素3水平L9（34）正交試驗。

1.3.4 菌株形態、培養和生理生化鑒定

菌株的形態、培養和生理生化特征的鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[9]、《伯杰細菌鑒定手冊》第八版[10]進行。

1.3.5 菌株16S rDNA鑒定及分析

菌種委托北京三博遠志生物科技公司進行測序，測序結果通過BLAST與GenBank中的序列進行比對，構建出系統發育樹及鑒定。

1.3.6 菌株及菌株分泌纖維素酶耐酒精性能分析

將搖瓶發酵復篩纖維素酶活力較高的菌株，接種于酒精耐受液體培養基中，37℃培養48 h，然后進行平板計活菌。配制不同酒精含量的CMC-Na 1.0%的底物，按耐酒精纖維素酶活力的測定方法，測定纖維素酶在不同酒精含量時的保持率。

2 結果與分析

2.1 耐酒精纖維素酶產生菌平板初篩

在乙醇5.0%-CMC-Na1.0%平板上能夠生長且出現水解圈菌落，測量其水解圈和菌落的直徑，計算水解圈和菌落的直徑比，部分菌株（編號Lys-1214、1209、1467、1468）結果見圖1。由圖1可知，在乙醇-CMC-Na平板長出的單菌落較多，共獲得單菌落1 000多株，隨著酒精體積分數的增加，水解圈和菌落的直徑均有所減小，但二者的比例變化不大。可見，酒精含量對纖維素酶產生菌的生長和酶的分泌或者酶活性產生阻遏或抑制作用。由于液態的酒精在固體平板中容易揮發，實際的酒精含量要低些。

圖1 乙醇-CMC-Na剛果紅平板初篩纖維素酶產生菌Fig.1 Screening of cellulose-producing strain on ethanol-CMC-Na plate colored by Congo red

2.2 菌株的搖瓶發酵復篩

根據初篩的結果，選擇水解圈和菌落的直徑之比＞4的菌株50余株進行搖瓶發酵復篩。結果表明，菌株Lys-1249具有較高的酶活力，菌株Lys-1249在培養基配方為麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.01%，培養基初始pH 6.0，培養溫度37℃，發酵周期48 h的條件下，纖維素酶活力達到123.35 U/m L。

2.3 正交試驗優化菌株Lys-1249產酶條件

根據單因素發酵結果，選取麩皮、蛋白胨、溫度、pH值進行L9（34）正交試驗，結果見表1。從表1可以看出，通過9組發酵條件組合進行試驗，酶活力得到較大提高，最高達到132.10 U/m L；從R值的大小RA＞RC＞RB＞RD可以看出，影響因素由強到弱依次為麩皮、溫度、蛋白胨、pH值；從K值分析可得出最佳發酵條件組合為A2B2C3D2，即麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，溫度37℃、pH 7.0。經驗證，在麩皮2.0%，蛋白胨0.6%，溫度37℃、pH 7.0條件下接種菌株Lys-1249產纖維素酶，耐酒精纖維素酶活力達158.54 U/m L，與學者[11]從酒糟中分離細菌固體發酵纖維素酶活力（261.7 U/g）處于同一水平，但后者未揭示其酒精耐受性能。

表1 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2.4 菌株Lys-1249形態和生理生化特征

通過形態觀察及生理生化試驗，菌株Lys-1249營養細胞為桿狀，桿端鈍圓，菌落呈細皺狀，在液體培養基表面形成銀白色的菌膜，能夠液化明膠，還原硝酸鹽，不產生H2S，水解淀粉，葡萄糖發酵產酸不產氣，需氧，28～39℃生長良好，芽孢橢圓或柱形，芽孢常見中生，革蘭氏染色呈陽性，與芽孢桿菌屬（Bacillus）中的枯草芽孢桿菌相似。

2.5 菌株Lys-1249的16S rDNA鑒定及分析

菌株Lys-1249的16S rDNA經測序，序列已提交Gen-Bank數據庫，登錄號為KM 924828，并通過BLAST與Gen-Bank數據庫中已知的細菌序列進行檢索比對，構建出系統發育樹，結果見圖2。從圖2可以看出，菌株Lys-1249枯草芽孢桿菌親緣最近，結合形態分析，該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 菌株Lys-1249的系統發育樹Fig.2 Phy logene tic tree of stra in Lys-1249

2.6 菌株Lys-1249耐酒精性能及菌株Lys-1249分泌纖維素酶耐酒精性能分析

將菌株Lys-1249接種于含有不同酒精度的液體培養基中，37℃培養48 h，用平板涂布法計活菌數（配方同斜面培養基），結果見圖3。從圖3可以看出，隨著培養基酒精的增加，培養基中活菌數逐漸減少。菌株Lys-1249耐受酒精的程度與張靈等[12]報道的纖維素分解菌鏈霉菌-13大約相當，不過鏈霉菌-13所產的纖維素酶耐受酒精程度，未見后續報道。

配制酒精含量（0～10.0%）-CMC-Na 1.0%的底物，按纖維素酶活力的測定方法，測定菌株Lys-1249纖維素酶對不同酒精度的保持率，結果見圖4。從圖4可以看出，隨著底物中酒精度的增加，菌株Lys-1249纖維素酶活性逐漸下降，當酒精度為6.0%vol，可保持原有纖維素酶65.95%活性；酒精度為10.0%vol，纖維素酶活性僅剩余10.01%。與學者[13]通過誘變獲得黑曲霉獲得天然纖維素降解菌株Aspergillus niger sp.CA-10所產纖維素酶的耐酒精性能（10%vol）處于同一水平，但Lys-1249所保留的纖維素酶活較高。

圖4 酒精含量對菌株Lys-1249纖維素酶活性的影響Fig.4 Effects of ethanol content on strain Lys-1249 cellulase activities

3 結論

國家發改委就我國生物燃料產業發展作出階段性的統籌安排，預計到2020年，我國生物燃料消費量將占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有國際競爭力的生物燃料產業[14]。本研究以羧甲基纖維素鈉為單一碳源，培養基中通過添加乙醇，施加環境選擇壓力，獲得1 000多株耐不同程度酒精纖維素酶產生菌。盡管平板固體培養基中酒精在培養過程中有所揮發，但從結果看來，隨著酒精度的增加，纖維素酶產生菌的水解圈和菌落直徑菌有所減少，酒精對細菌生長及其纖維素酶活性影響很大，從研究結果可以判斷，該方法用于初篩耐酒精菌株及其纖維素酶是比較可靠的，國內外報道鮮見。

枯草芽孢桿菌Lys-1249不僅菌株本身能耐受較高濃度的酒精度，其纖維素酶（纖維素內切酶）也能耐受6.0%vol的酒精，其活力保持近65%，二者具有一致性。結果表明，產耐酒精纖維素酶酶活力最高的單因素條件為：培養基麩皮含量2.0%，蛋白胨含量0.6%，培養基初始pH值為7.0，發酵溫度37℃，發酵周期48 h。通過正交試驗得到各因素對酶活力的影響強弱為A＞C＞B＞D，說明因素A即培養基麩皮含量對產酶影響最大，因素D即培養基起始pH值對酶活影響最小，正交試驗的最佳組合為A2B2C3D2。在此最佳條件下產酶活力為158.54 U/m L，驗證了正交優化的結果是Lys-1249產纖維素酶的最佳條件。

本研究通過改良纖維素內切酶測定方法，即在1.0% CMC-Na底物中添加5.0%vol的酒精，初步探索了耐酒精纖維素酶研究方法，為后續研究提供參考。枯草芽孢桿菌Lys-1249是一株原始野生菌，其纖維素酶主要是內切酶（試驗數據未列出），其水解纖維素的能力與商品化的木霉纖維素酶相比，是有較大差距的，但有望進一步通過誘變[15]或基因改良，獲得產酶能力更高的突變株或基因工程菌，顯示該菌具有一定的應用前景。

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Screening,identification of an alcohol-tolerance cellulase-producing strain and its characteristics

HUANG He,LIN Yuanshan,ZHOU Yi,RAO Liqun,LU Xiangyang*
(College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

An ethanol-tolerant strain Lys-1249 with cellulase activity was screened from the mature fermented grain mash by ethanol-CMC-Na plate preliminary screening and shake flask fermentation affination.Strain Lys-1249 was identified as Bacillus subtilis according to morphological observation,physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis.The cellulose-producing condition was optimized by orthogonal experiment,and results showed that the ethanol-tolerant cellulase activity reached 158.54 U/m l when strain Lys-1249 was cultured in the condition of wheat bran 2.0%,peptone 0.6%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO47H2O 0.02%,MnSO40.01%,initial pH 7.0,temperature 37℃and time 48 h.The strain also grew well in medium with 6.0%vol ethanol,and the cellulase activity can keep at 69.95%.

cellulase;screening;identification;alcohol;fermentation

Q 93-331

A

0254-5071（2015）03-0062-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.014

2015-01-06

湖南省科技計劃博士后專項資金（2012RS4042）；湖南省研究生科創資金（CXS20113B298）

黃河（1990-），男，碩士研究生，主要從事微生物發酵的相關研究工作。

*通訊作者：盧向陽（1962-），男，教授，博士，研究方向為農業副產品綜合利用，作物生理生化研究。