黃芩抗蕃茄晚疫病菌抑菌成分的提取條件優(yōu)選

李曉娟，李正英

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

黃芩抗蕃茄晚疫病菌抑菌成分的提取條件優(yōu)選

李曉娟1，李正英2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

采用恒溫水浴浸提法，以無水乙醇作為提取溶劑，研究了提取時(shí)間、提取溫度、料液比及提取次數(shù)對黃芩粗提物抗蕃茄晚疫病菌抑菌效果的影響。正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝條件為溫度65℃，提取時(shí)間1.0 h，料液比1∶45（g∶m L），浸提2次，此時(shí)抑菌圈直徑為34.3 mm。最小抑菌濃度為15.7 mg/m L。

黃芩；蕃茄晚疫病菌；提取工藝；最小抑菌濃度

黃芩（Scutellaria baicalensis）為唇形科多年草本植物黃芩的根，別名黃金茶或空心草，為常用中藥，性寒味苦[1]。產(chǎn)于河北、遼寧、陜西、山東、內(nèi)蒙古、黑龍江等地，具有清熱解毒等作用[2]。研究表明，黃芩中主要有效成分為黃酮類化合物[3]。蕃茄晚疫病原菌（Phytophthora infestans）屬于致病疫菌，它是世界蕃茄和馬鈴薯生產(chǎn)的巨大病害之一。由于其潛伏期短，侵染力強(qiáng)，傳播速度非常快，常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[4]。然而，現(xiàn)今使用的農(nóng)藥大多為有機(jī)磷農(nóng)藥，殘留大，對人類的健康有很大的傷害。

目前，世界各國對植源性成分的提取分離及其抑菌機(jī)制等進(jìn)行了大量的研究[5-7]。其中，已報(bào)道的具有抑菌作用或有協(xié)同抑菌作用的中藥有效成分有很多，其中黃酮類化合物是一種生物活性很高的物質(zhì)[8]。關(guān)于提取多種中草藥的有效成分及其抑菌機(jī)理的報(bào)道還有很多[9-10]，一般來說，中草藥性溫，無殘留，對人體沒有傷害，并且易于購買，價(jià)格低廉。因此，提取其中的有效成分來開發(fā)天然抑菌劑來代替現(xiàn)有的農(nóng)藥是一個(gè)很好的途徑。

本研究對于黃芩的提取采用溶劑提取法[11]，對于黃芩中有效成分的提取工藝優(yōu)選采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，抑菌活性檢測采用牛津杯法[12]，以期為黃芩作為天然抑菌劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芩（Scutellaria baicalensis）：呼和浩特市京遠(yuǎn)大藥房；蕃茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程技術(shù)系微生物實(shí)驗(yàn)室保存并提供；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、無水乙醇均為分析純：天津市化學(xué)試劑三廠；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基及馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40型立式電蒸汽壓力滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；VD-1320型無菌操作臺(tái)：哈爾濱東聯(lián)電子公司；MJX-150BX型霉菌培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；THZ-98AB型恒溫振蕩器：上海一恒科技有限公司；DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀：上海雷磁新徑儀器有限公司；SC-04型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將蕃茄晚疫病原菌接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，活化3次，將第三代菌種采用平板計(jì)數(shù)法，用滅菌后的生理鹽水稀釋成1×106CFU/m L的菌懸液[13]。

1.3.2 黃芩中抑菌物質(zhì)的提取工藝流程

稱取黃芩干粉5 g→置于250 mL三角瓶中→加入提取溶劑→水浴恒溫浸提→真空抽濾→收集第一次濾液→收集沉淀→加入溶劑→第二次水浴恒溫浸提→真空抽濾→收集濾液→合并二次濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干→加入10 m L蒸餾水溶解→冷凍干燥得粉末[14]

將干燥后的粉末0.5 g溶于5 m L蒸餾水中，制備抑菌液待用。

1.3.3 抑菌方法

采用牛津杯法[12]。配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃后倒入滅菌后的培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后加入200 μL菌懸液，涂布棒涂布均勻。將滅菌后的牛津杯置于培養(yǎng)皿中，向其中注入200 μL抑菌液，霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)3 d，測量抑菌圈直徑大小并記錄，平行3次，取平均值。

抑菌圈直徑（mm）=測量值-牛津杯直徑

1.3.4 抑菌物質(zhì)提取工藝

提取溶劑的選擇：稱取5.00g黃芩干粉，依次加入以下溶劑：乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正丁醇、體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%的乙醇、無水乙醇、水，料液比1∶20（g∶m L），40℃條件下水浴恒溫提取，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測量抑菌圈的大小選取最佳溶劑，平行3次，取平均值。

提取溫度的選擇：稱取5.00 g黃芩干粉，加入選取的最佳溶劑，料液比1∶20（g∶m L），分別在20℃、35℃、50℃、65℃及75℃條件下水浴提取，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測量抑菌圈的大小選取最適溫度，平行3次，取平均值。

料液比的選擇：稱取5.00 g黃芩干粉，加入選取的最佳溶劑，在選取的最適溫度條件下水浴提取，料液比分別為1∶30、1∶35、1∶40、1∶45及1∶50（g∶m L），進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測定抑菌圈的大小選取最適料液比，平行3次，取平均值。

提取時(shí)間的選擇：稱取5.00 g黃芩干粉，加入最佳溶劑，在最適的料液比，最適溫度條件下分別提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h及3.0 h，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測定抑菌圈的大小選取最佳提取時(shí)間，平行3次，取平均值。

浸提次數(shù)的選擇：稱取5.00 g黃芩干粉，參照先前選取的最適條件，分別水浴提取1、2、3、4次，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測定抑菌圈的大小選取最佳浸提次數(shù)，平行3次，取平均值。

正交優(yōu)化試驗(yàn)：選取影響提取效率的因素提取溫度（A）、提取料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D），根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果通過L16（44）的正交試驗(yàn)[15]，比較不同處理的抑菌效果來確定最佳提取條件。

1.3.5 最小抑菌濃度的測定

采用藥液和培養(yǎng)基混合法[16]。將粗提物冷凍干燥成粉末狀，采用二倍稀釋法[17]，配制系列梯度：125.0 mg/m L、62.5mg/m L、31.3mg/m L、15.7mg/m L、7.9mg/m L、4.0mg/m L、2.0 mg/m L、0。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入2 m L藥液和18 m L PDA培養(yǎng)基，混合均勻，待其凝固后，加入200 μL菌懸液，涂布均勻，置于霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃培養(yǎng)3 d，觀察是否長出菌落，未長出菌落的最小濃度即為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)選

由圖1可知，石油醚提取液的抑菌圈直徑為0，除無水乙醇外提取液的抑菌圈直徑在20～30 mm，無水乙醇作為提取溶劑時(shí)其抑菌圈直徑為30.7 mm。根據(jù)溶質(zhì)的相似相溶[11]原理，結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)才能易于混溶，因此選擇無水乙醇作為最佳提取溶劑。

圖1 溶劑對粗提物抑菌效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on antibacterial results of extrac ting so lution

2.2 提取溫度的選擇

圖2 不同提取溫度對提取液抑菌效果的影響Fig.2 Effects of different temperature on antibacterial results of extracting solution

由圖2可知，隨著提取溫度的增高，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，但不是溫度越高越好。因?yàn)闊o水乙醇的沸點(diǎn)是80℃左右，在提取過程中會(huì)大量蒸發(fā)掉，所以選擇75℃作為最佳提取溫度。

2.3 料液比的優(yōu)選

圖3 不同料液比對提取液抑菌效果的影響Fig.3 Effects o f different solid-liquid ratio on antibacterial results of extracting solution

由圖3可知，隨著提取溶劑用量的增加，物料與溶劑的接觸面積增大，有效成分的浸出也隨之加快，抑菌活性增強(qiáng)。當(dāng)料液比在1∶40～1∶50（g∶m L）時(shí)，抑菌效果逐漸趨于穩(wěn)定，料液比達(dá)到1∶45（g∶m L）時(shí)抑菌圈的直徑最大為30 mm。因此，選擇1∶45（g∶m L）作為最適宜的料液比。

2.4 提取時(shí)間的優(yōu)選

圖4 不同提取時(shí)間對提取液抑菌效果的影響Fig.4 Effects o f different extracting time on antibacterial results of extracting solution

由圖4可知，提取時(shí)間為0.5～2.0 h時(shí)，隨提取時(shí)間的延長，提取液的抑菌效果逐漸增加，而在2.0～3.0 h時(shí)，提取時(shí)間越長，提取液的抑菌效果越差，表明其抑菌物質(zhì)可能被分解。因此選擇2.0 h作為最佳提取時(shí)間。

2.5 浸提次數(shù)的優(yōu)選

由圖5可知，當(dāng)提取次數(shù)為1～2次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增多，抑菌效果也逐漸增高。當(dāng)提取次數(shù)為2～4次時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，提取液的抑菌效果逐漸趨于平緩。當(dāng)提取次數(shù)3次時(shí)，其抑菌圈的直徑達(dá)到了28.7 mm。所以選擇3次作為最適宜的提取次數(shù)。

圖5 不同提取次數(shù)對提取液抑菌效果的影響Fig.5 Effects of different extraction times on antibacterial results of extracting solution

2.6 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

通過采用正交設(shè)計(jì)，確定了提取條件的最優(yōu)組合。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表1，方差分析見表2。由表1可知，各因素的R值大小順序?yàn)镽A＞RC＞RD＞RB，即各因素對蕃茄晚疫病菌抑制效果影響的主次關(guān)系為提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞提取次數(shù)（D）＞料液比（B）。綜合考慮各因素對蕃茄晚疫病原菌的影響效果，確定了最佳配方組合為A2B3C1D2，即最佳提取溫度為65℃，最佳提取時(shí)間為60m in，最佳料液比為1∶45（g∶m L），最佳提取次數(shù)為2次。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，抑菌圈直徑為34.3 mm。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，4個(gè)因素對結(jié)果的影響均不顯著。

2.7 最小抑菌濃度試驗(yàn)

以已知的試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行最小抑菌濃度的測定。通過觀察，粗提液質(zhì)量濃度為31.3～125mg/m L，平板內(nèi)皆無菌落生長；粗提液濃度為15.7mg/m L時(shí)，平板內(nèi)出現(xiàn)極少數(shù)菌落；粗提液質(zhì)量濃度為0～7.9 mg/m L，菌落數(shù)量隨粗提液質(zhì)量濃度的減少不斷增加。因此，確定15.7 m g/m L為黃芩粗提液的最小抑菌濃度。

3 結(jié)論

通過對黃芩抗蕃茄晚疫原菌有效成分提取條件的研究結(jié)果表明，以無水乙醇作為黃芩的提取溶劑，65℃水浴提取1.0 h，料液比為1∶45（g∶m L），提取次數(shù)為2次時(shí)，黃芩粗提物的抑菌效果最佳，此時(shí)抑菌圈直徑為34.3 mm。黃芩粗提液對蕃茄晚疫病原菌的最小抑菌濃度為15.7 mg/m L。由此可知，黃芩粗提液中的有效成分對于蕃茄晚疫病菌有一定的抑菌作用，可以為開發(fā)黃芩天然抑菌劑提供很好的理論基礎(chǔ)。

[1]滕占才，王波，梁英.黃芩中黃芩苷常規(guī)回流浸提工藝優(yōu)化研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：70-73.

[2]王娜，黃曉偉，趙書豪，等.黃芩提取物的制備及其有效成分的測定[J].香料香精化妝品，2011（6）：21-24.

[3]史高峰，張興潛，祝娟娟，等.黃芩總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].應(yīng)用化工，2011，40（11）：1973-1979.

[4]宋琳琳，李正英，陳萍.五倍子抗蕃茄晚疫病原菌有效成分提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（10）：269-271.

[5]吳宗澤.巴天酸模中大黃素抗真菌機(jī)理的研究[D].長春：吉林大學(xué)碩士論文，2010.

[6]ITO H,UCHIYAMA S,TABE N,et al.CD and UV absorption bandshapes of DNA-acridime orange complexes:Influence of the interactions of purine-pyrimidine base pairs with dyes in intercalated model complexes[J].Chem Phys Lett,1989,162(12):103-109.

[7]孫為屹.大蒜素對家禪病原真菌抑菌作用及機(jī)理的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2006.

[8]陳禹先，周彤，謝鯤鵬，等.黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)制的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（12）：2000-2006.

[9]云寶儀，周磊，謝鯤鵬，等.黃芩素抑菌活性及其機(jī)制的初步研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（12）：1587-1592.

[10]曾超珍，劉志祥，韓磊.黃芩總黃酮提取技術(shù)及其抑菌活性研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（6）：1342-1343.

[11]盧艷花.中藥有效成分提取分離技術(shù)[J].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[12]李正英，張保軍，陳忠軍.雜交瓠瓜中抑菌物質(zhì)提取條件的優(yōu)選[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：209-212.

[13]李正英，張保軍，陳忠軍，等.雜交瓠瓜中抗菌組分的分離及其抗菌活性研究[J].食品科學(xué)，2008，29（10）：112-114.

[14]宋琳琳.五倍子中抗蕃茄晚疫病菌有效成分的提取分離及抑菌效果的研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2013.

[15]王欽德，楊堅(jiān).食品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[M].第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010.

[16]韓雯雯.番瀉葉抑菌成分的提取分離與抑菌作用研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012.

[17]周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測定方法[M].重慶：科學(xué)技術(shù)出版社重慶分社，1987.

2015中國調(diào)味品展招商啟動(dòng)

2015年11月23-25日，由中國調(diào)味品協(xié)會(huì)主辦的2015中國（國際）調(diào)味品及食品配料博覽會(huì)將在上海光大會(huì)展中心召開，目前相關(guān)的展會(huì)招商工作已經(jīng)全面啟動(dòng)。

本屆展會(huì)將繼續(xù)保留以往的特色專區(qū)，如機(jī)械設(shè)備專區(qū)、國際企業(yè)專區(qū)、中華老字號(hào)專區(qū)、火鍋調(diào)味料專區(qū)、醬腌菜專區(qū)、腐乳專區(qū)、名優(yōu)食醋專區(qū)和地方政府專區(qū)。此外，今年還將增設(shè)包裝材料、包裝設(shè)計(jì)專區(qū)和檢測設(shè)備專區(qū)。預(yù)計(jì)展覽面積將超15 000 m2，參展企業(yè)將超過400家。

展會(huì)同期，2015年中國調(diào)味品產(chǎn)業(yè)營銷高峰論壇、全國調(diào)味品經(jīng)銷商（上海）發(fā)展論壇、第六屆中國調(diào)味品新配料技術(shù)論壇、2015調(diào)味品行業(yè)科技論壇、第三屆中國火鍋文化節(jié)、全國烹飪大賽及名廚表演活動(dòng)等多個(gè)營銷論壇、技術(shù)論壇以及主題文化推廣活動(dòng)將繼續(xù)開展。此外，2015年正值中國調(diào)味品協(xié)會(huì)成立20周年，CFE2015同期將舉辦盛大的慶典活動(dòng)，屆時(shí)協(xié)會(huì)將對調(diào)味品行業(yè)二十年發(fā)展歷程作一個(gè)回顧和總結(jié)，對調(diào)味品行業(yè)未來發(fā)展的方向作前瞻性探討。

摘自中國調(diào)品味協(xié)會(huì)信息

Optimization of extraction conditions of anti-tomato-late-blight components from Scutellaria baicalensis

LI Xiaojuan1,LI Zhengying2*
(1.College of Food Science and Engineering,Inner M ongo lia Agricultural University,Hohhot 010000,China; 2.College of Vocational Technical Institute,Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109,China)

Constant temperature water bath extraction was used to extract baicalin from Scutellaria baicalin with anhydrous ethanol.The effects of extracting time,extraction temperature,solid-liquid ratio and extraction times on antibacterial effect of tomato late blight from radix S.bacteriostatic was discussed.The optimal extraction process was determined by orthogonal experiment and the minimum bacteriostasis concentration was determined.The results showed the optimum conditions were as follow s:extraction temperature 65℃,extracting time 1.0 h,solid-liquid ratio 1∶45(g∶m l), extraction times 2.Under this condition,the inhibitory zone diameter was 34.3 mm.The minimum inhibitory concentration(MIC)was 15.7 mg/m l.

Scutellaria baicalensis;tomato late blight;extraction technology;M IC

TS201.1

A

0254-5071（2015）03-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.025

2015-01-08

李曉娟（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

*通訊作者：李正英（1964-），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。