炭黑氨基柱凈化HPLC-ICP-MS測定黃酒中砷形態及含量

宋偉華，胡貝貞，韓 超，董文洪

（1.紹興出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，浙江紹興312000；2.溫州出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江溫州325000）

炭黑氨基柱凈化HPLC-ICP-MS測定黃酒中砷形態及含量

宋偉華1，胡貝貞1，韓 超2，董文洪1

（1.紹興出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，浙江紹興312000；2.溫州出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江溫州325000）

建立了一種同時測定黃酒中亞砷酸根、砷酸根、砷甜菜堿、一甲基砷酸和二甲基砷酸等5種砷形態的高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)分析方法。黃酒經炭黑氨基柱凈化，體積分數為10%甲醇水溶液洗脫，采用Hamilton PRP-XIO0陰離子交換色譜柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)，60 mmol/L硝酸銨梯度洗脫，高效液相色譜分離，電感耦合等離子體質譜進行定性和定量分析。在0.5～20.0 μg/L范圍內各砷形態線性良好，相關系數R均＞0.999；加標回收率85%～92%，相對標準偏差(RSD)1.4%～5.2%；5種砷形態的定量限均為0.10 μg/L，檢出限均為0.03 μg/L。利用該方法對不同年份、不同企業及不同類型的黃酒進行了檢測，該方法適用于黃酒中砷殘留的分析檢測。

高效液相色譜；電感耦合等離子體質譜；砷形態；黃酒

砷（As）是一種自然界中廣泛存在的元素，大量的砷化物以不同的形態存在于與人類密切相關的水、氣和食物中。砷對人的毒性不僅與元素總量有關，還與元素存在的化學形態密切相關[1]，如亞砷酸根（arsenite，AsⅢ）和砷酸根（arsenate，AsV）等無機砷的毒性較大，國際癌癥研究委員會已將無機砷列為強致癌性物質，一甲基砷（monomethylated arsenic，MMA）、二甲基砷（dimethylated arsenic，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）和砷膽堿（arsenocholine，AsC）等有機砷毒性很小。因此食品中砷的安全評價，形態分析比總量分析具有更重要的意義。

對食品、中藥、沉積物、水等的砷、硒、鉛、碘等形態分析已有報道[2-8]，然而由于黃酒的區域性、元素及其形態相關的研究甚少，無論國家標準還是國外標準，均未有相關的規定。李博斌等[9]對黃酒中無機元素成分與黃酒口味品質的定量關系做了研究；程和勇等[10]則對不同風味的黃酒、白酒、啤酒以及葡萄酒中的重金屬含量進行了測定；有學者[11]用電感耦和等離子體發射光譜法首次測定了生產黃酒用曲及原料中的K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、P、Se等10種人體必需的宏量元素和微量元素，更多的文獻則是對黃酒風味和功能的研究。對于黃酒中各元素形態的分析更少，還有學者[12]提到在黃酒這種酸性介質中，無機元素存在狀態為有機鹽類物質，表現形式為生物活性物質。本實驗通過前期的檢測工作發現，在黃酒中砷的總量比較高，最高者達56 μg/L，高于飲用水標準對砷的要求。砷的形態不同，其對人體的危害也不一樣，如全部為無機砷其毒性則大大增加，因而確定其存在黃酒中的形態就非常重要。目前，測定元素形態方法最常用的是液相或離子色譜與電感耦合等離子體質譜[13]或者熒光光譜[14]的聯用。考慮到使用的方便性，本研究建立了炭黑氨基柱凈化，高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLCICP-MS）測定黃酒中砷形態及其含量，可以明確黃酒中砷存在形態，為監管部門的監管及企業生產工藝的改進和黃酒品質的提高提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsV）、砷膽堿（AsB）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）標準品購于中國計量研究院。黃酒樣品由紹興地區黃酒生產企業提供。

試驗用水由Milli.Q Element A 10超純水儀制得，用于配制實驗所有標準溶液與樣品溶液。硝酸與氨水分別由多功能純化器純化后再使用。

60 mm ol/L的硝酸銨：取3.95 m L純化后的硝酸，定容至1 000 m L，用純化后的氨水調pH至9.0。

1.2 儀器與設備

Aurora M 90電感耦合等離子體質譜：美國布魯克.道爾頓公司；Millli-Q ElementA 10超純水儀：德國Millipore公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）：瑞士漢密爾頓公司；DHJ-8多功能純化器：美國加州儀器有限公司；炭黑氨基柱（500 mg/6 m L）：杭州福裕科技服務有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

移取黃酒樣品1.0m L，加入已活化好的炭黑氨基柱中，然后以9.0 m L體積分數為10%的甲醇水溶液進行洗脫，收集塑料離心管中用于砷形態的檢測。

1.3.2 砷的測定

高效液相色譜（HPLC）條件：色譜柱為Hamilton PRPXI00陰離子交換色譜柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）；流動相為60 mmol/L硝酸銨，梯度洗脫：0～2.5 min硝酸銨60%，2.51～3.0 min硝酸銨60%→100%并保持至5.5 min，5.51 min時硝酸銨降至60%，沖洗至7.5 min；流速1.5 m L/m in；柱溫為室溫；進樣體積50 μL。

電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）：射頻功率1 400 W；等離子氣體流速18 L/m in；輔助氣流速1.8 L/m in；鞘氣流速0.2 L/m in，霧化器流速：1.0 L/m in，駐留時間（Dwell）：80000μs；碰撞氣&輔助氣：70m L/min氫氣（H2）及140m L/min氮氣（N2）。

式中：ω為砷回收率，%；C測為儀器測定砷質量濃度，μg/L；V樣為樣品體積，m L；C標為標液質量濃度，μg/L；V標為加標體積，μL；C空為空白酒樣測定質量濃度，μg/L。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇及優化

2.1.1 前處理方法的選擇

本實驗在文獻[1-4]的基礎上，比較了不同前處理的方法，如直接進樣、微波灰化溶解進樣、固相萃取柱凈化、炭黑氨基柱凈化等。結果表明，直接進樣方便，但由于黃酒中含有豐富的糖、氨基酸、色素等營養成分，使得譜圖基線偏高，且檢測再現性差，設備污染嚴重。微波灰化可以消除掉部分基質的影響，但由于受到灰化溫度的限制，導致各形態回收率損失嚴重。最終選取了炭黑氨基柱凈化后洗脫稀釋進樣的方式進行處理，效果較佳。

2.1.2 前處理方法的優化

黃酒富含氨基酸、蛋白質、糖、色素等多種有機物，對砷（As）在色譜柱上的形態分離會有干擾，同時，高含量的氨基酸、蛋白質等有機物也容易對離子色譜柱造成損傷，因此有必要在樣品進色譜柱前進行凈化處理。考慮到樣品的基質特性，選取對氨基酸、蛋白質及色素有較好吸附能力的炭黑氨基萃取小柱作為凈化柱。通過對活化后的炭黑氨基柱的空白洗脫液測試發現，里面含有一定量砷酸根（AsV）的殘留，采用25.0 m L超純水洗脫后，基本能清除殘留在凈化柱中的砷酸根（AsV）。

1.0 m L空白溶液（含20.0 μg/L的As混標）過凈化柱后，分別用9.0 m L純水、體積分數為5%、10%的甲醇洗脫，收集洗脫液定容至10.0 m L，測定砷的形態及含量，并計算回收率，結果如表1所示。

經過色譜分離，5種形態的砷根據保留時間的不同確定其形態，同時通過質譜掃描得到的峰面積與質量濃度的關系回歸校正方程，建立校正曲線，用于回收率及實際樣品的測試。砷的回收率計算公式如下：

表1 過柱后的各個砷形態物質的加標回收率Table 1 Standard addition recovery rates of 5 arsenic speciations after elution

由表1可知，無機形態的砷（As3+和As5+）均為無機離子狀態，對洗脫溶劑中是否含有甲醇變化不顯著，且9.0 m L的洗脫溶劑能基本把目標物洗脫完全。對于有機形態的砷如AsB、MMA、DMA等，洗脫溶劑中的甲醇含量提高，有利于目標物被洗脫。且9.0 m L體積分數為10%的甲醇水溶液能基本洗脫完全目標物，所有的物質回收率在95.3%～98.7%。因而，采用9.0 m L體積分數為10%的甲醇溶液作為洗脫液。

2.2 儀器條件的選擇

根據實驗發現，氫氣（H2）作為As檢測的碰撞氣具有更好的效果，選擇H2作為其截取錐面碰撞氣，優化出碰撞氣流速為70 m L/min。同時，由于再加氮氣作為輔助氣可以提高As的等離子化效率，引入氮氣（N2）作為輔助氣，優化出流速為140 m L/m in。

據漢密爾頓色譜柱的應用說明報道，以硝酸銨作為流動相，PRP-X 100陰離子交換色譜柱對砷的形態分離具有分離效果，考慮到溶液配制的方便性，嘗試用硝酸銨作為流動相來洗脫目標物，經過優化后，0.2μg/L的5種形態砷的分離高效液湘質譜圖結果見圖1。

圖1 五種砷標樣高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of mixed standards of five arsenic species

由圖1可知，在上述儀器條件下5種形態的砷能在較短時間內得到比較好的分離。

2.3 質譜分析條件的優化

聯機前使用布魯克·道爾頓公司提供的調諧液鈹（Be）、鎂（Mg）、鈷（Co）、銦（In）、鋇（Ba）、鈰（Ce）、鉈（Tl）、鉛（Pb）、釷（Th）（質量濃度1.0 μg/L）對ICP-MS進行調諧，以保證儀器的最佳狀態和儀器狀態的穩定性。砷的電離能較高，難以電離，采用高電離能1 400 W，保證各種砷形態的完全解離，同時調節采樣深度、載氣流速以及炬管位置，提高檢測靈敏度同時降低氧形態和雙電荷的比率，滿足氧形態產率為氧化鈰/鈰（CeO/Ce）＜1.5%，雙電荷產率鈰2+/鈰（Ce2+/Ce+）＜2.0%。

在測定黃酒中的砷+75（As+75）時，樣品中的氯35（Cl35）容易與氬40（Ar40）或鈣40（Ca40）形成氯化氬+75（ArCl+75）或氯化鈣+75（CaCl+75）干擾檢測，因此需要利用儀器具備的錐面碰撞技術加入碰撞氣以消除多原子離子如A rCl+75和CaCl+75對As+75的干擾。實驗前調節ICP-MS參數以獲得最優信噪比（S/N），并保證基線的穩定性。

2.4 線性關系、測定低限、添加回收率及精密度

2.4.1 線性關系

配制質量濃度為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L的5種砷形態的混合標準溶液，上機檢測。以各形態峰面積（Y）為縱坐標，相應各種形態砷的質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程，并將0.5μg/L的混標溶液逐級稀釋，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，結果如表2所示。

表2 砷形態線性關系及檢出限Table 2 Linear range and detection limit of As

由表2可知，在0.5～20.0 μg/L范圍內，5種砷形態標準曲線線性良好，相關系數均＞0.999。5種砷形態的定量限均為0.10 μg/L，檢出限均為0.03 μg/L。

2.4.2 回收率及精密度試驗

在實驗室內再現性條件下對添加標準溶液黃酒樣品進行測定，驗證方法的準確性和精密度，結果見表3。由表3可知，在3個加標質量濃度下回收率在85.2%～94.6%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）1.4%～5.2%，檢測結果表明該方法的準確性和精密度良好。

表3 黃酒樣品回收率及精密度試驗結果Table 3 Standard addition recovery rates and precision of Chinese rice wine

2.4.3 方法的驗證

不同的實驗室對加標2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L含有基質的樣品，按照本研究所采用的方法對回收率和穩定性進行了驗證，結果如表4所示。

表4 方法驗證結果Table 4 Verification results of the method

由表4可知，檢測結果的室間RSD均在0.5%～4.5%，說明該方法是可行的。

2.5 實際樣品的檢測

選取砷總量含量較高的黃酒酒樣，對不同的酒樣中的砷形態及含量進行了測定并確定了各形態的含量。結果如表5～表7所示。表7同廠家不同品種的酒中各類砷的檢測結果

表5 不同廠家不同年份不同類型酒中各類砷的檢測結果Table 5 Detection results of arsenic in different types of the winesfrom different companies in different years μg/L

表6 同年份不同廠家酒中各類砷的檢測結果Table 6 Detection results of arsenic in the wines from different companies in the same year μg/L

Table 7 Detection results of arsenic in different types of the wines from the same company μg/L

由表5～表7可知，在不同年份、不同類型、不同企業的酒中均含有砷酸根和一甲基砷，另外的形態不同的酒略有差異，但多數存在亞砷酸根和甜菜堿。極個別的酒含有二甲基砷。無機砷的含量之和幾乎全部＞10 μg/L，這比國標GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》[15]總砷的限量還高，應該引起有關部門重視。這些元素的來源將是下一步的研究方向。

3 結論

黃酒經炭黑氨基柱凈化，體積分數為10%甲醇水溶液洗脫，采用Hamilton PRP-XIO0陰離子交換色譜柱（4.1 mm× 250 mm，10 μm），60 mmol/L硝酸銨梯度洗脫，高效液相色譜分離，電感耦合等離子體質譜進行定性和定量分析。在0.5～20.0 μg/L范圍內各砷形態線性良好，相關系數R均＞0.999；加標回收率為85.2%～94.6%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～5.2%；5種砷形態的定量限均為0.10 μg/L，檢出限均為0.03 μg/L。利用該方法對不同年份、不同企業及不同類型的黃酒進行了檢測，明確了基酒和成品酒中砷存在的形態及其含量。有助于消費者選擇性的采購和監管部門采取相應的措施。

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Simultaneous analysis of arsenic speciations and contents in rice wine by HPLC-ICP-MS

SONG Weihua1,HU Beizhen1,HAN Chao2,DONG Wenhong1
(1.Comprehensive Technologic Service Center of Shaoxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shaoxing 312000,China; 2.Inspection and Quarantine Center,Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Wenzhou 325000,China)

An analytical method for simultaneous determination of five arsenic speciations(arsenous acid radical,arsenate,arsenobetaine,MMAA, DMAA)in Chinese rice wine was developed by HPLC-ICP-MS.Samples were purified by carbon black amino column,10%methanol aqueous solution elution.The HPLC separation was performed on Hamilton PRP-XI00 negative ion analytical column(4.1 mm×250 mm,10 μm)utilizing a gradient elution program of 60 mmol/L ammonium nitrate as the mobile phase.Identification and quantification were achieved by ICP-MS.In the range of 0.5-20.0 μg/L,good linearity of 5 arsenic speciations was observed with correlation coefficients above 0.999.The adding standard recovery ranged from 85%to 92%with the relative standard deviations of 1.4%-5.2%.The quantification limits of five arsenic speciations were 0.10 μg/L,and the detection limits were 0.03 μg/L.The proposed method was applied to the simultaneous determination of five arsenic speciations in different types of Chinese rice wine from different years and different companies,and results showed that the method was suitable for arsenic residues determination in Chinese rice wine.

HPLC;ICP-MS;arsenic speciations;Chinese rice wine

O657

A

0254-5071（2015）03-0145-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.035

2015-01-15

浙江省公益性技術應用研究（分析測試）項目（2013C37095）

宋偉華（1982-），女，工程師，碩士，主要從事食品工業品檢測工作。