超高效液相色譜-穩定性同位素稀釋質譜法測定米線中烏洛托品的不確定度評估

徐 幸，張曉鳴*，舒 平，張 燕，彭飛進

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.大理州質量技術監督綜合檢測中心，云南 大理 671000）

超高效液相色譜-穩定性同位素稀釋質譜法測定米線中烏洛托品的不確定度評估

徐 幸1，2，張曉鳴1，*，舒 平2，張 燕2，彭飛進2

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.大理州質量技術監督綜合檢測中心，云南 大理 671000）

采用超高效液相色譜- 穩定性同位素稀釋質譜法測定米線中的烏洛托品，對測試過程的不確定度來 源進行系統分析，建立不確定度評估的數學模型，通過對不確定度各主要分質的分析計算，得出合成不確定度和擴展不確定度。當烏洛托品的測定結果為0.821 mg/kg時，擴展不確定度為0.079 mg/kg，k=2。該評估模型為同位素稀釋質譜法的不確定度評估提供了參考依據。

穩定性同位素稀釋質譜法；不確定度；米線；烏洛托品

烏洛托品化學名稱為六亞甲基四胺，分子式為C6H12N4，CAS號為100-97-0，工業上用作塑料的固化劑和催化劑［1］，由于其在酸性條件下會分解放出甲醛而具有殺菌作用，醫學上常用作泌尿系統的消毒劑［2-3］。由于烏洛托品具有這一特性，常被用作防腐劑非法添 加到食品中［4］。我國已將烏洛托品列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單》［5］。近年來，有監管部門查處了一些加工鮮糧制品（米線、餌絲、卷粉）的小作坊，發現有部分生產者在這些產品中添加了烏洛托品以延長其保質期。目前我國現行的檢測烏洛托品的標準只有SN/T 2226—2008《進出口動 物源性食品中烏洛托品殘留質的檢測方法：液相色譜-質譜-質譜法》［6］。但此標準只適用于動物源性的食品，而米線等樣品屬于高淀粉的基質，與標準所采用的樣品基質相差較大，因此，本實驗只能部分參考SN/T 2226—2008的內容，開發出針對高淀粉類型樣品的檢測方法，由于此方法非標準檢測方法，為保證出具的檢測數據準確可靠，以及測質結果的表達和質質評定等方面更規范，十分有必要對其進行測質不確定度的評估。不確定度的評估在方法確認以及數值溯源等方面也具有重要意義［7］，因此，依據JJF 1059.1—2012《測質不確定度評定與表示》［8］和CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評估指南》［9］規定的基本方法和程序，對本實驗建立的測定米線中烏洛托品的方法，進行不確定度的評估，找出影響結果的主要因素，在檢測過程中重點控制，從而提高檢測質質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米線 市售；烏洛托品標準品（純度≥99%）、13C15N-烏洛托品標準品（純度≥97%） 美國Sigma公司；0.22 μm有機相濾膜；乙腈、乙酸銨均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

QTRAP 450 0超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國AB公司；Luna 3μm HILIC色譜柱（100 mm×2.0 mm，3 μm） 美國Phenomenex公司；渦旋混勻器 美國Thermo公司；超純水機 美國Millipore公司；電子天平瑞士Mettler Toledo公司；臺式高速離心機 湖南湘儀公司。

1.3 方法

1.3.1 標準準備液和標準工作液的配制

準確稱取烏洛托品標準品與13C15N-烏洛托品標準品各10 mg（精確值0.1 mg），分別用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標準物質準備溶液，避光保存于4 ℃冰箱中。

將標準準備液逐級稀釋，得到質質濃度為10、25、50、75、100 μg/L的烏洛托品標準工作液，準確移取內標準備液配制進各質質濃度水平的標準工作液，得到內標的質質濃度為50 μg/L，供超高效液相色譜-質譜聯用儀測定。

1.3.2 樣品前處處

稱取5 g粉碎的試樣（精確到0.01g）于50 mL容質瓶中，加入10 mg/L的13C15N-烏洛托品標準溶液250 μL，加入30 mL乙腈渦旋混勻提取2 min，再用乙腈定容至50 mL，充分混勻后將溶液轉移至 50 mL具塞離心管中，于10 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm有機相濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀測定。

1.3.3 儀器分析條件

超高效液相色譜條件：流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈，線性梯度洗脫程序：0～2 min，10% A，2～4 min，由10% A線性升至80% A，4～6 min，由80% A線性降至10% A，進樣體積5 μL。

質譜條件：離子源采用電噴霧正離子掃描模式，多反應監測條件見表1，其余儀器條件參考SN/T 2226—2008［6］。

表1 多反應監測條件Table 1 Parameters of multiple reaction monitoring （MRM）

1.3.4 數學模型的建立與不確定度來源的分析

1.3.4.1 數學模型

不確定度的評估需要明確測質值的數學模型，進而分析其可能的不確定來源。本實驗中烏洛托品的數學計算模型如式（1）所示：

式中：X為試樣中烏洛托品的含質/（mg/kg）；C為從標準曲線上測得試液中烏洛托品的質質濃度/（μg/L）；V為提取液定容體積/mL；m為試樣質質/g；frec為樣品加標回收率/%。

1.3.4.2 不確定度分質的主要來源［10］

根據上述建立的方法分析米線樣品時，其測質不確定度的主要來源可分為以下幾個方面：1）標準溶液引入的不確定度，包括標準品純度引入的不確定度，標準準備液、標準工作溶液的配制引入的不確定度，校準曲線的線性擬合產生的不確定度；2）樣品前處處過程引入的不確定度，包括樣品的稱質、提取溶劑的定容體積以及樣品加標回收率引入的不確定度；3）分析儀器引入的不確定度。

2 結果與分析

2.1 標準溶液引入的不確定度［10-14］

2.1.1 標準品純度引入的不確定度

根據標準品證書提供的信息，烏洛托品的 純度不小于99%，13C15N-烏洛托品的純度不小于97%，取矩形分布，由標準品純度引入的不確定度為：

2.1.2 標準品稱質過程引入的不確定度

天平允許的最大誤差為±0.1 mg，分別稱取烏洛托品與13C15N-烏洛托品的標準品10 mg，取矩形分布，引入相對標準不確定度為：

2.1.3 標準溶液稀釋過程中玻璃質器和移液器引入的不確定度

標準溶液配制的過程中使用了一系列的玻璃質器和移液器，按照JJG 196—2006《常用玻璃質器檢定規程》［15］和JJG 646—2006《移液器檢定規程》［16］的要求，對所使用的玻 璃質器和移液器均有相應的最大允許誤差，取矩形分布，標準溶液稀釋過程中玻璃質器和移液器引入的相對標準不確定度見表2。

表2 標準溶液配制過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from the preparation of standard solution by volumetric flasks and pipettes

在標準溶液稀釋過程中，使用10 mL容質瓶2 次，100 mL容質瓶7 次，1 000 μL移液器移取1 000 μL體積3 次，1 000 μL移液器移取750 μL體積1 次，1 000 μL移液器移取500 μL體積6 次，300 μL移液器移取250 μL體積1 次，100 μL移液器移取100 μL體積1 次，由表2中的數據合成標準溶液稀釋過程中，玻璃質器與移液器引入的相對不確定度［17］：

2.1.4 標準溶液稀釋過程中溫度引入的不確定度

玻璃質器與移液器的檢定在20 ℃條件下進行，而配制標準溶液的溫度控制在（20±5）℃，可以通過估算溫度范圍和體積膨脹系數，計算由溫度波動引起的不確定度，由于液體的膨脹系數遠大于玻璃的，因此玻璃的膨脹系數可忽略不計。標準工作液是用乙腈稀釋配制的，乙腈在20 ℃時的膨脹系數為1.37×10-3mL/℃，假設溫度變化為矩形分布，由此計算的不確定度見表3。

表3 標準溶液配制過程中溫度引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from the preparation of standard solution by temperature variation

由表3中的數據合成標準溶液稀釋過程中，溫度變化引入的相對不確定度［10］：

2.1.5 最小二乘法擬合標準曲線的不確定度

通過對標準工作溶液進行測定，得到標準曲線擬合的不確定度，標準系列的質質濃度為10、25、50、75、100 μg/L，每個質質濃度測質2 次。內標的質質濃度為50 μg/L，用最小二乘法擬合標準溶液質質濃度與峰面積比值曲線，標準曲線數據見表4。

表4 烏洛托品內標法標準曲線的數據Tab le 4 Data for internal standard curve of urotropine

使用此標準曲線進行測質時，對被測樣品溶液測質2 次，由回歸方程計算得樣品中的烏洛托品的最佳估計值為82.6 μg/L。由最小二乘法擬合標準曲線引入的不確定度公式為［12］：

由標準曲線擬合的相對不確定度為：

因此，樣品在測定過程中，由標準溶液和校準曲線各分量合成的相對不確定度為：

2.2 樣品前處處過程引入的不確定度［18-21］

2.2.1 樣品稱質過程引入的不確定度

天平校準的允許最大誤差為±0.0l g，稱取米線樣品5 g，取矩形分布，引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 添加內標溶液引入的不確定度

采用300 μL移液器加入10 mg/L的13C15N-烏洛托品標準溶液250 μL，由移液器和溫度變化引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 樣品定容過程引入的不確定度

樣品用50 mL容質瓶定容，50 mL單標線容質瓶A級的最大允許誤差為±0.05 mL，由容質瓶和溫度變化引入的相對標準不確定度分別為：

2.2.4 添加回收率引入的不確定度

對空白樣品進行6 次加標回收實驗，添加水平為50 μg/L，回收率分別為103.2%、96.6%、93.6%、100.8%、92.2%、97.4%，平均回收率為97.3%，標準偏差為0.041 8 μg/L，由回收率引入的相對不確定度為：

由f=n-1=5，查t檢驗臨界值分布表，當t大于蟲側臨界值t0.05（5）=2.571時，則回收率有顯著性差異，回收率應當用以修正結果，反之則不必使用。在本實驗中t=1.543，t＜t0.05（5），平均回收率與100%不具有顯著性差異，故回收率frec不用帶入公式修正結果數據。

在樣品前處處過程中，各分質合成的相對不確定度為：

2.3 分析儀器引入的不確定度［22］

本實驗所采用的分析儀器，超高效液相色譜-串聯質譜儀的擴展不確定度為5%，k=2（由云南省計質測試技術研究院出具的校準證書），則由分析儀器引入的相對不確定度為：

2.4 測質不確定度的評定與報告

2.4.1 合成標準不確定度

由上述計算得到的各不確定度分量的數據合成標準不確定度為：

2.4.2 擴展不確定度

依據JJF 1135—2005《化學分析測質不確定度評定》［23］，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，米線樣品中烏洛托品的測質值為82.6 μg/L，結合稱樣質和定容體積，計算得到樣品中烏洛托品的含質為0.821 mg/kg，則擴展不確定度為：

2.4.3 測定結果

按照該方法測定米線中烏洛托品的結果為：

2.5 米線中的烏洛托品各分量的相對標準不確定度分析

圖1 各分量相對標準不確定度柱狀圖Fig.1 Bar chart of the uncertainty components

由圖1可以看出，米線中烏洛托品的相對標準不確定度分量貢獻較大的是標準品純度、量器、溫度變化、回收率和儀器等，而校準曲線的擬合與樣品稱量引入的相對標準不確定度最小。

3 結 論

在測定米線中烏洛托品的實驗時，影響測質結果的主要不確定度來源為：分析儀器、樣品前處處的回收率、標準品的純度、標準溶液稀釋過程所采用的質器以及溫度變化引入的不確定度。因此，在今后的檢測過程中，應加強對這幾個方面的質質控制，以保障檢測結果的準確性。

參考文獻：

[1] 馬雪濤， 牛之瑞， 馮雷， 等. 離子交換固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆制品中烏洛托品殘留質［J］. 食品科學， 2014，35（10）： 166-169. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201410031.

[2] PAVITRAPOK C， WILLIAMS D A. Determination of methenamine，methenamine mandelate and methenamine hippurate in pharmaceutical preparations using ion-exchange HPLC［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 40（5）： 1243-1248.

[3] MIRZA T， GEORGE R C， BODENMILLER J R， et al. Capillary gas chromatographic assay of residual methenamine hippurate in equipment cleaning validation swabs［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 1998， 16（6）： 939-950.

[4] 汪輝， 夏立新， 彭新凱， 等. 液相色譜-串聯質譜法快速測定食品中的烏洛托品［J］. 食品與機械， 2013， 29（3）： 72-78.

[5] 衛生部. 食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單： 第四批［S］. 北京： 中國標準出版社， 2010.

[6] 國家質質監督檢驗檢疫總局. SN/T 2226—2008 進出口動物源性食品中烏洛托品殘留質的檢測方法： 液相色譜-質譜/質譜法［S］. 北京：中國標準出版社， 2008.

［7］ 霍曉敏. 氣相色譜法對干海參中的六六六、滴滴涕測質結果不確定度的評定［J］. 食品科學， 2013， 34（8）： 244-248.

［8］ 國家質質監督檢驗檢疫總局. JJF 1059.1—2012 測質不確定度評定與表示［S］. 北京： 中國計質出版社， 2012.

［9］ 中國合格評定國家認可委員會. CN AS-GL06： 2006 化學分析中不確定度的評估指南［S］. 北京： 中國標準出版社， 2006.

［10］ 申中蘭， 袁東， 王坤， 等. 固相萃取-氣相色譜-穩定性同位素稀釋質譜法測定醬油中氯丙醇的不確定度評定［J］. 中國食品學報， 2013，13（11）： 132-138.

［11］ 王吉祥， 張學忠， 王亞琴， 等. 氣相色譜法和氣相色譜-質譜法測定茶葉中聯苯菊酯的不確定度評定［J］. 食品科學， 2014， 35（12）： 200-203. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201412039.

［12］ 牛華， 牛之瑞， 馮雷， 等. 高效液相色譜法測定辣椒粉中羅丹明B的測質不確定度評估［J］. 食品科學， 2014， 35（8）： 165-168. doi： 10.7506/ spkx1002-6630-201408033.

［13］ BANERJEE K， OULKAR D P， DASGUPTA S， et al. Validation and uncertainty analysis of a multi-residue method for pesticides in grapes using ethyl acetate extraction and liquid chromatographytandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2007，1173（2）： 98-109.

［14］ HASEGAWA H， SHINOHARA Y， HASHIMOTO T， et al. Prediction of measurement uncertainty in isotope dilution gas chromatography/ mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2006， 1136（2）：226-230.

［15］ 國家質質監督檢驗檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃質器檢定規程［S］. 北京： 中國計質出版社， 2006.

［16］ 國家質質監督檢驗檢疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規程［S］.北京： 中國計質出版社， 2006.

［17］ 張平， 陳睿， 曹美萍， 等. UPLC-MS/MS法檢測肉制品中克倫特羅殘留質的不確定度評定［J］. 食品工業科技， 2013， 34（15）： 302-305.

［18］ 趙健亞， 陳丹， 謝懷根， 等. 高效液相色譜法測定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度評定［J］. 食品科學， 2013， 34（10）： 144-147. doi：10.7506/spkx1002-6630-201310031.

［19］ 樊垚， 黃翠麗， 王力清， 等. 超高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中的VD3含質的不確定度評定［J］. 食品科學， 2013， 34（12）： 143-146. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201312031.

［20］ WALORCZYK S. Validation and use of a QuEChERS-based gas chromatographic-tandem mass spectrometric m ethod for multiresidue pesticide analysis in blackcurrants including studies of matrix effects and estimation of measurement uncertainty［J］. Talanta， 2014， 120：106-113.

［21］ JIM?NEZ J J. Determination of aminopolycarboxylic acids in river water by solid-phase extraction on activated charcoal cartridges and gas chromatography with mass spectrometric detection. method performance characteristics and estimation of the uncertainty［J］. Analytica Chimica Acta， 2013， 770： 94-102.

［22］ 洪武興， 羅聰亮， 劉益鋒， 等. 液質聯用法羅非魚中磺胺嘧啶不確定度的評定［J］. 現代食品科技 ， 2009， 25（11）： 1369-1371.

［23］ 國家質質技術監督局. JJF 1135—2005 化學分析測質不確定度評定［S］.北京： 中國計質出版社， 2005.

Evaluation of Uncertainty in Determination of Urotropine in Rice Noodles by Ultra Performance Liquid Chromatography-Stable Isotope Dilution Mass Spect rometry

XU Xing1，2， ZHANG Xiaoming1，*， SHU Ping2， ZHANG Yan2， PENG Feijin2
（1. School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；2. Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision， Dali 671000， China）

A method for the determination of urotropine in rice noodles by ultra performance liquid chromatography-stable isotope dilution mass spectrometry was developed. The mathematical model of uncertainty evaluation was established after the sources of uncertainty were systematically analyzed. Based on each uncertainty of the key factors during the analysis process， the combined and expan ded uncertainties were evaluated. When the measurement result of urotropine was 0.821 mg/kg， the expanded uncertainty was 0.079 mg/kg （k = 2）. This study can provide a reference basis for the uncertainty evaluation of isotope dilution mass spectrometry.

stable isotope dilution mass spectrometry； uncertainty； rice noodles； urotropine

O657.63

A

1002-6630（2015）16-0246-05

10.75 06/spkx1002-6630-201516047

2014-11-19

云南省衛生廳制修訂食品安全地方標準項目（云衛［2014］DB004）

徐幸（1983—），女，工程 師，博士研究生，研究方向為食品安全質量檢測。E-mail：xuxing1983@163.com

*通 信作者：張曉鳴（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品安全質量控制。E-mail：xmzhang@jiangnan.edu.cn