不同發酵方式的泡菜揮發性成分分析

徐丹萍，蒲 彪，*，劉書亮，卓志航，張 楠

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業大學林學院，四川 雅安 625014）

不同發酵方式的泡菜揮發性成分分析

徐丹萍1，蒲 彪1，*，劉書亮1，卓志航2，張 楠1

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業大學林學院，四川 雅安 625014）

為研究不同發酵方式泡菜中揮發性成分的差異，采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對自然發酵、老泡菜水發酵、腸膜明串珠菌發酵、植物乳桿菌發酵和短乳桿菌發酵5 種不同發酵方式的泡菜及泡菜原料中揮發性成分進行檢測分析，得到不同種類化合物共55 種。利用相對氣味活度值確定了各類泡菜及原料中的主體風味成分的種類。結果表明，不同泡菜中的主體風味成分種類差異較大，僅壬醛是各類泡菜的共有主體風味成分，對結球甘藍泡菜風味影響最大。通過主成分分析結果可知，老泡菜水發酵、短乳桿菌發酵和甘藍原料的風味在整體上明顯不同，而腸膜明串珠菌、植物乳桿菌發酵泡菜與自然發酵泡菜在總體風味成分上較為接近，并與壬醛、異硫氰酸烯丙酯、右旋萜二烯關聯較大。

泡菜；揮發性成分；主體風味；主成分分析

泡菜鮮香、脆嫩、爽口，其獨特風味的形成是在以乳酸菌為主要菌群的作用下通過厭氧發酵形成的［1］。泡菜的發酵方式主要包括傳統發酵和純種發酵2 種方式。傳統發酵方式的應用以家庭、小作坊生產為主，在切分好的新鮮蔬菜中直接加入鹽水或者老泡菜水進行發酵。純種發酵方式則主要應用在工業生產中，在新鮮蔬菜中加入鹽水外接入一定濃度的純種乳酸菌，以提高生產效率。目前，國外對純種發酵泡菜技術研究較為深入［2-3］，在保證泡菜風味、口感、品質與傳統發酵泡菜一致的前提下，形成了一套完善的泡菜生產體系。國內泡菜的工業化生產起步較晚，傳統發酵與純種發酵泡菜風味的研究還不是非常健全［4-5］。

本實驗選取具有代表性的發酵早期優勢菌種腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和發酵中期優勢菌種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）作為純種發酵實驗的接種劑接入泡菜中進行發酵，與自然發酵和老泡菜水發酵泡菜的風味進行對比、分析，同時以泡菜原料作為對照探究發酵方式對揮發性成分的影響。采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術對不同發酵方式的結球甘藍泡菜及泡菜原料中揮發性成分進行鑒定，通過相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法獲得不同發酵方式的泡菜在主體風味成分上的差異，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）得出不同泡菜在整體風味上的異同，以期為泡菜中風味成分的進一步研究及泡菜工業化生產的深入探究提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

新鮮結球甘藍 市購。選擇色澤正、無破損、無蟲害、無霉變的新鮮結球甘藍作為實驗材料。老泡菜水由四川農業大學食品學院農產品加工與貯藏工程實驗室提供。培養2 a、各項指標相對穩定。

植物乳桿菌菌種、短乳桿菌菌種、腸膜明串珠菌菌種由四川農業大學食品學院微生物實驗室提供。

MRS培養基［6］用于菌種活化；氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀（配有HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）） 美國安捷倫公司；SPME裝置（65 μm DVB/PDMS萃取頭） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處處

結球甘藍原料（F）經整處、清洗、瀝干、切分、紫外殺菌之后裝入5 L陶土壇，按照下列不同操作方式分別進行老泡菜水發酵（A）、自然發酵（B）及純種發酵（植物乳桿菌發酵（C）、短乳桿菌發酵（D）和腸膜明串珠菌發酵（E））。

老泡菜水發酵：按蔬菜與老泡菜水質質比1∶2的比例加入老泡菜水，15 ℃密封發酵。

自然發酵：按蔬菜與食鹽水質質比1∶2的比例加入質質分數4%食鹽水，15 ℃密封發酵。

純種發酵：按蔬菜與食鹽水質質比1∶2的比例加入質質分數4%食鹽水，同時以質質分數2%的比例分別接入108CFU/mL植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌純培養液，15 ℃密封發酵。

從發酵第0天開始每隔24 h取樣測定酸度及感官評分，共測定7 d。取酸度達質質分數0.3%～0.5%，感官評價最優時的泡菜進行揮發性成分的檢測。甘藍原料直接取樣測定。

1.3.2 揮發性物質檢測

揮發性物質的提取和檢測條件參照蔣麗等［7］的方法并進行優化改進。取切碎后的樣品5 g置于15 mL頂空進樣瓶中密封。43 ℃條件下平衡30 min后，將萃取頭插入進樣瓶，吸附30 min后取出萃取頭插入到GC進樣口，推出纖維頭，250 ℃解吸5 min。

1.3.3 GC-MS分析條件

色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱溫35 ℃（保留5 min），以5 ℃/min升到75 ℃，保持1 min，以1 ℃/min升到90 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升到150 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升到200 ℃，保持5 min。

電子電離源；離子源溫度230℃；電子能質70 eV；接口溫度280 ℃；質質掃描范圍50～550 u。

1.4 數據分析

定性：檢測的未知化合物與NIST.11 library相匹配，對匹配度大于800（最大值為1 000）的鑒定結果予以確認；利用C7～C30作為混標計算各化合物的保留指數（retention index，RI），結合文獻報道對化合物進行定性。

定質：以峰面積歸一化法確定不同原料中各化合物的相對含質。

主體風味成分確定：采用ROAV法［8］評價揮發性成分對泡菜風味貢獻的大小。定義對樣品風味貢獻最大的組分ROAVstan=100，其他組分按下式計算：

式中：Cr,i、Ti分別為各揮發性組分的相對含質/%和感覺閾值/（μg/kg）；Cr,stan、Tstan分別為對樣品風味貢獻最大的組分的相對含質/%和感覺閾值/（μg/kg）。

PCA：對得到的揮發性成分采用SPSS統計軟件進行PCA［9］，得到不同發酵方式泡菜及甘藍原料在整體風味上的差異。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式泡菜揮發性成分檢測結果

對5 種不同發酵方式的泡菜及甘藍原料進行揮發性成分檢測，得到總離子流圖如圖1所示。通過檢測分析得到揮發性成分相對含質及部分化合物的感覺閾值和氣味描述如表1所示［10-14］。

由表1可得，6 種樣品中共檢出化合物55 種，其中酯類13 種、醇類9 種、烴類8 種、醛類6 種、芳香族化合物4 種、萜類3 種、酸類、酮類各2 種、酚類1 種、其他化合物7 種。

老泡菜水發酵泡菜中檢出化合物20 種，相對含質較高的物質是異硫氰酸烯丙酯（40.317%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（31.251%）、1-壬醇（4.471%）、苯乙醇（3.844%）、3-甲基異硫氰酸丁酯（3.043%）等；自然發酵泡菜中檢出化合物15 種，相對含質較高的物質是異硫氰酸烯丙酯（49.862%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（40.314%）、壬醛（2.638%）、3-甲基異硫氰酸丁酯（2.008%）等；植物乳桿菌發酵泡菜中檢出

化合物20 種，相對含質較高的物質是異硫氰酸烯丙酯（53.081%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（39.412%）、葉醇（2.671%）等；短乳桿菌發酵泡菜中檢出化合物19 種，相對含質較高的物質是2，4-二甲基噻唑（24.496%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（15.452%）、異硫氰酸烯丙酯（14.739%）、棕櫚酸（7.866%）、3，5-二叔丁基苯酚（7.106%）等；腸膜明串珠菌發酵泡菜中檢出化合物17 種，相對含質較高的物質是異硫氰酸烯丙酯（36.809%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（36.593%）、3-（甲硫基）丙基異硫氰酸酯（5.972%）、戊基環丙烷（4.388%）等；甘藍原料中共檢出化合物11 種，葉醇（45.712%）、二甲基二硫（17.601%）、二甲基三硫（14.911%）、正己醇（12.983%）、異硫氰酸烯丙酯（4.596%）等的相對含質較高。與甘藍原料中揮發性成分相比，發酵后泡菜中揮發性成分種類明顯增多，物質含質發生明顯變化。

表1 不同發酵方式的泡菜及甘藍原料中揮發性成分種類及相對含量測定結果Table 1 Volatile components and their relative contents in pickles fermented with different starter cultures and head cabbage

續表1

圖1 不同發酵方式的泡菜及甘藍原料中揮發性成分GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in pickles fermented with different starter cultures and head cabbage

酯類尤其是異硫氰酸酯類在不同發酵方式的泡菜中相對含質最高，說明異硫氰酸酯類可能是甘藍泡菜的特征性風味物質。有學者對自然和接種發酵泡菜的香氣成分進行分析，得到不同發酵方式中香氣成分均已酯類和硫化物為主［7］，與本研究結果相似。異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、壬醛、右旋萜二烯、4-（甲硫基）丁腈在5 種不同發酵方式中均被檢出，可能是形成甘藍泡菜獨特風味的重要物質。甘藍原料的揮發性成分中醇類相對含質最高，其次分別是硫醚類和酯類化合物，未檢出酸類、酚類、醛類、酮類等化合物，與不同發酵方式的泡菜中揮發性成分種類及相對含質差異較大，主要原因是受到發酵環境中微生物種類及數質的影響［15-16］。

2.2 主體風味成分的確定

泡菜主體風味成分不但受到揮發性物質相對含質的影響，而且與風味閾值密切相關［17］。根據表1列出的部分化合物的感覺閾值及相對含質，壬醛在老泡菜水發酵、自然發酵、短乳桿菌發酵和腸膜明串珠菌發酵泡菜中相對含質均在1%以上，且感覺閾值為1 μg/kg，對4 種發酵方式的泡菜風味貢獻最大，因此定義壬醛在這4 種發酵方式中ROAVstan=100。同處，定義二甲基三硫在植物乳桿菌發酵泡菜及甘藍原料中ROAVstan=100。計算得到其他化合物的ROAV如表2所示。當ROAV不小于1時，認為揮發性物質為泡菜的主體風味成分；當0.1≤ROAV＜1時，認為揮發性物質對泡菜總體風味具有重要貢獻［11］。

表2 不同發酵方式泡菜中揮發性成分的ROAVTable 2 ROAV of volatile flavor compounds in different pickles

從表2可知，老泡菜水發酵泡菜中的主體風味成分是壬醛、乙酸異戊酯、庚醇、癸酸乙酯、芳樟醇、異硫氰酸烯丙酯、右旋萜二烯、1-壬醇、3-辛醇、苯乙醇，主要呈現脂香、果香、辛香、花香；自然發酵泡菜中主體風味成分是壬醛、異硫氰酸烯丙酯、癸醛、甲基壬基甲酮、右旋萜二烯，主要呈現脂香、辛香、花香；植物乳桿菌發酵泡菜中主體風味成分是二甲基三硫、二甲基二硫、壬醛，主要呈現蔥香、蔬菜香、脂香；短乳桿菌發酵泡菜中主體風味成分是壬醛、正己酸乙酯、芳樟醇、右旋萜二烯、苯乙醛，主要呈現脂香、果香、花香；腸膜明串珠菌發酵泡菜中主體風味成分是壬醛、右旋萜二烯、異硫氰酸烯丙酯、1-壬醇、葉醇，主要呈現脂香、檸檬香、辛香；甘藍原料中主體風味成分是二甲基三硫和二甲基二硫，主要呈現蔬菜香、洋蔥香。

一般認為，C8～C12的飽和醛具有較好的風味［18］，壬醛呈脂肪香、青草香味，是5 種不同發酵方式的主體風味，對以結球甘藍為原料的泡菜風味形成具有重要影響。二甲基硫化物具有蔥香、蔬菜香，雖然含質較少，但其感覺閾值較低，是植物乳桿菌發酵泡菜的重要風味成分，與陳功等［19］的研究結果相似。不同發酵方式泡菜中微生物種類及數質差異較大，不同種類微生物通過代謝周圍環境中的營養物質，產生一系列風味物質。例如，乳酸菌可以利用環境中的葡萄原通過同型乳酸發酵、異型乳酸發酵產生乳酸、乙醇、乙酸、二氧化碳等。據報道，乳酸菌可以對泡菜中檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸產生乙酸和草酰乙酸［20］，也可以利用氨基酸產生苯乳酸和乙酸苯酯、苯乙醇等物質［21］。這些風味物質既可以相互發生化學反應生產新的物質，又可以與泡菜原料中的物質（如硫氰酸酯類、萜類、芳樟醇等）反應，產生復雜的風味成分［22］，因此不同發酵方式中主體風味成分種類及相對含質差異較大。

2.3 主要風味物質的PCA

為進一步分析揮發性成分對泡菜整體風味的影響，根據表2中ROAV選取6 種樣品中所有的主體風味成分共17 種物質進行PCA，按照表1中的序號分別命名為v2、v3、v4……v52。利用SPSS軟件得到主成分個數及累積方差貢獻率如表3所示。提取的3 個主成分能夠累積方差貢獻率達到90.027%，其中PC1累積方差貢獻率最大，達到40.213%，其次分別是PC2（28.863%）和PC3（20.952%）。

表3 主成分累積方差貢獻率Table 3 Cumulative variance contribution rates of principal components

圖2 風味成分主成分散點圖Fig.2 PCA scatter diagram for key odor compounds

圖3 不同發酵方式的泡菜和甘藍原料主成分散點圖Fig.3 PCA scatter diagram for different pickles

如圖2、3所示，一般前2 個主成分基本反映原始數據的基本信息［23］。從圖2得出，PC1上的主要風味成分是庚醇、苯乙醇、3-辛醇、乙酸異戊酯、癸酸乙酯和1-壬醇；PC2上的主要風味成分是壬醛、苯乙醛和正己酸乙酯等。

從圖3可以看出，老泡菜水發酵泡菜在PC1上與其他5 種樣品距離較遠，區分老泡菜水發酵泡菜與其他泡菜及原料風味的主要風味成分是庚醇、苯乙醇、3-辛醇、乙酸異戊酯等；短乳桿菌發酵泡菜在PC2正半軸上與其他樣品距離較遠，區分短乳桿菌發酵泡菜與原料及其他泡菜的主要風味成分是壬醛、苯乙醛、正己酸乙酯等。同處，葉醇、二甲基二硫、二甲基三硫等是區分甘藍原料與發酵泡菜的主要風味成分。

老泡菜水發酵泡菜、短乳桿菌發酵泡菜和甘藍原料在主成分散點圖上距離較遠，說明三者風味差異較大。老泡菜水中微生物種類、數質較多，經發酵后改變了原料原來的揮發性成分，產生風味物質比較復雜，而短乳桿菌發酵泡菜雖然也改變了原料揮發性成分，但是菌種較為單一，因此與老泡菜水發酵泡菜風味差異大。自然發酵泡菜、腸膜明串珠菌發酵泡菜、植物乳桿菌發酵泡菜在主成分散點圖上相距較近，其原因可能是腸膜明串珠菌主要存在于泡菜發酵的早期，隨著有機酸積累很快死亡，隨后植物乳桿菌在發酵中期迅速繁殖［24］，造成腸膜明串珠菌發酵對泡菜中后期風味影響較小，與直接接種植物乳桿菌發酵的泡菜風味接近。另據文獻［25-26］報道，自然發酵泡菜的早期和中期優勢菌種分別為腸膜明串珠菌和植物乳桿菌，因此接種這2種優勢菌種的泡菜雖然發酵速度更快，但是成熟期風味與自然發酵風味相似。與這3 種發酵泡菜關系較為密切的風味成分是壬醛、異硫氰酸烯丙酯和右旋萜二烯。

3 結 論

通過GC-MS對5 種不同發酵方式的結球甘藍泡菜及甘藍原料的揮發性成分進行分析，共檢出酯類、酸類、酚類、 醛類、酮類、醇類、烴類、芳香族化合物、萜類、含氮化合物、含硫化合物和雜環化合物55 種，其中酯類在不同發酵方式的泡菜中相對含質均最高，是結球甘藍泡菜的特征性風味成分。

受到泡菜中微生物的影響，不同泡菜中主體風味成分種類差異較大。壬醛是不同泡菜中共有的主體風味成分，且在除植物乳桿菌發酵泡菜外的其他4 種泡菜中ROAV最高，對以結球甘藍為原料的泡菜風味形成具有重要影響。二甲基三硫雖然相對含質不高，但感覺閾值較低，對植物乳桿菌發酵泡菜的風味影響最大。

通過PCA得到老泡菜水發酵、短乳桿菌發酵泡菜和甘藍原料的風味在整體上明顯不同。自然發酵泡菜與腸膜明串珠菌發酵、植物乳桿菌發酵泡菜在整體風味上較為接近，與3 種泡菜風味關聯較大的風味成分是壬醛、異硫氰酸烯丙酯和右旋萜二烯。

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Analysis of Volatile Components in Pickles Fermented with Different Starter Cultures

XU Danping1， PU Biao1，*， LIU Shuliang1， ZHUO Zhihang2， ZHANG Nan1
（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

Volatile components of head cabbage pickles fermented with different starter cultures and head cabbage were extracted by headspace solid phase micro-extraction （HS-SPME） and analyzed by gas chromatograph-mass spectrometry （GC-MS）. A total of 55 compounds were identified. Relative odor activity value （ROAV） was used to evaluate the critical odor compounds in different pickles. The results showed that there was a great difference in the chemical classes of odor compounds in different pickles and only 1-nonanal was detected in all the pickles. The principal component analysis （PCA） indicated that the overall flavors of head cabbage and pickles fermented by old brine and Lactobacillus brevis were obviously different. On the contrary，pickles from natural fermentation and fermention by Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus plantarum were similar in the overall flavor which had a close relationship with 1-nonanal， allyl isothiocyanate and D-limonene.

pickles； volatile components； key odor compounds； principal component analysis （PCA）

TS255.54

A

1002-6630（2015）16-0094-07

10.7506/spkx1002-6630-201516017

2014-12-31

國家自然科學基金面上項目（31171726）；四川省科技支撐計劃項目（2012NZ0002）

徐丹萍（1988—），女，碩士研究生，研究方向為果蔬加工理論與技術。E-mail：dpingx2008@163.com

*通信作者：蒲彪（1956—），男，教授，學士，研究方向為果蔬加工理論與技術。E-mail：pubiao2002@163.com