基因多態(tài)性與中國閩南地區(qū)散發(fā)性帕金森病的相關(guān)性研究

·論著·

基因多態(tài)性與中國閩南地區(qū)散發(fā)性帕金森病的相關(guān)性研究

1)福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院福州3500012)廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院廈門361000

【摘要】目的研究SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)及LRRK2(rs1491942)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與中國閩南地區(qū)漢族人群散發(fā)性帕金森病(Sporadic Parkinson’s Disease, SPD)的相關(guān)性。方法收集2011-08-2013-12廈門市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院確診、臨床資料完整、明確無血緣關(guān)系的SPD患者168例，健康對(duì)照組177例，運(yùn)用SNaPshot技術(shù)對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)分析各SNP數(shù)據(jù)。結(jié)果(1)SPD組與對(duì)照組LRRK2基因rs1491942基因型頻率和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008/0.007)，(CC+CG)與GG相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；在各亞組中，LOPD(晚發(fā)型散發(fā)性帕金森病)組/女性組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006/0.001)。(2) SNSA(rs356221)、ITGA(rs7077361)基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論(1)LRRK2(rs1491942)基因單核苷酸多態(tài)性與中國閩南地區(qū)漢族女性晚發(fā)型散發(fā)性帕金森病發(fā)病相關(guān)，等位基因C可能是其發(fā)病的危險(xiǎn)因素。(2) SNSA(rs356221)、ITGA(rs7077361)基因單核苷酸多態(tài)性可能與中國閩南地區(qū)散發(fā)性帕金森病發(fā)病無關(guān)。

【關(guān)鍵詞】散發(fā)性帕金森病；單核苷酸多態(tài)性；SNCA；ITGA；LRRK2

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2012D062)

通訊作者方杰1) 郭名偉1)陳帥1)林青2)馬琪林1,2)()

【中圖分類號(hào)】R742.5

The associated research between gene polymorphism and sporadic Parkinson's disease in the Minnan region of China

FangJie＊,GuoMingwei,ChenShuai,LinQing,MaQilin

＊TheFirstClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou35001,China

Abstract【】 ObjectiveTo research the correlation between the SNP of SNCA(rs356221), ITGA8(rs7077361), LRRK2(rs1491942) and sporadic PD in the Minnan region of China. MethodsOne hundred and sixty eight inpatients and outpatients with complete clinical information of PD and without family history of PD, and one hundred and seventy seven healthy controls were respectively recruited at department of neurology and physical examination center in the first hospital of Xiamen from August 2011 to December 2013. The target gene loci was genotyped by the SNaPshot technique, and the SNP data were statistically analyzed by Chi-square test and Fisher exact probability method.Results(1) The genotype and allele frequencies of rs1491942 in LRRK2 showed statistically great difference between SPD group and control group (P=0.008/0.007), and there was statistically great significance between (CC+CG) and GG (P=0.003); According to age stratification and sex stratification, just LOPD and women's group showed statistically great difference compared with control group (P=0.006/0.001). (2) The genotype and allele frequencies of SNSA(rs356221)and ITGA(rs7077361)showed no statistically great difference between SPD group and control group (P=1.000).Conclusion(1)The SNP of LRRK2(rs1491942) may be related to late sporadic PD in women patients, and allele rs1491942-C may be a risk factor for Han Chinese in Minnan region. (2) The SNP of SNCA(rs356221) and ITGA8(rs7077361) may have nothing to do with SPD in the same area.

【Key words】Sporadic Parkinson's disease; Single Nucleotide Polymorphisms; SNCA; ITGA; LRRK2

帕金森病(PD)是一種常見于中老年人、發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)變性疾病。臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)障礙為主要特征。主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元大量變性缺失和神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)路易小體(Lewy body, LB)形成[1]。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，繼1996年P(guān)olymeropoulos等[2]在意大利家系中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)帕金森病相關(guān)基因(SNCA，PARK1)后，共命名至少18個(gè)帕金森病相關(guān)基因，特別是近些年來隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Studies,GWAS)的成熟，與帕金森病相關(guān)的易感基因位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，在不同人群、種族研究中被證實(shí)。目前世界各地區(qū)對(duì)SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)及LRRK2(rs1491942)基因單核苷酸多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性報(bào)道并不一致，目前中國大陸地區(qū)無關(guān)于SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)與SPD的報(bào)道，本研究旨在探討以上3個(gè)SNP位點(diǎn)與散發(fā)性帕金森病的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究帕金森病的遺傳機(jī)制提供依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象(1)SPD組：收集2011-08-2013-12就診于廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及病房診斷的臨床資料完整、無血緣關(guān)系的SPD患者168例，男94例(55.95%)，女74例(44.05%)；平均年齡(57.02±8.363)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國際公認(rèn)的1992年英國帕金森病協(xié)會(huì)腦庫診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[3]。(2)對(duì)照組：來自廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢志愿者177例，男96例，女81例；平均年齡(57.64±9.27)歲。2組性別、年齡、種族、居住地?zé)o顯著相關(guān)性(P>0.05)。2組人群均來自中國閩南地區(qū)漢族人群，主要包括廈門、泉州、漳州、莆田、三明、龍巖等地區(qū)SPD患者，本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意，所有受試者均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1樣本采集：抽取外周靜脈血2 mL，使用天根基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA，測DNA濃度和純度，將符合要求的DNA樣品存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)：用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，長度在200～500 bp，Tm值在60 ℃左右，并針對(duì)各位點(diǎn)的3’端前一個(gè)堿基設(shè)計(jì)一段位點(diǎn)探針。為區(qū)分不同的位點(diǎn)，在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或poly(dGACT)尾巴。引物具體信息如表1。

1.2.3PCR擴(kuò)增體系：采用模板DNA 1 μL，10×PCR Buffer (Mg2+free) 2 μL，MgCl2(50 mM)0.8 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，Platinum Taq (5 U) 0.5 μL，ddH2O 14.7 μL共20 μL反應(yīng)體系，使用預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性 95 ℃ 20 s、退火55 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 40 s共33個(gè)循環(huán)，終延伸 72 ℃ 5 min的擴(kuò)增過程，反應(yīng)結(jié)束后吸取PCR產(chǎn)物5 μL及1 μL 6×loading buffer(2×溴芬蘭)混合，置于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰，大小正確。

1.2.4SNaPshot延伸反應(yīng)：按照SNaPshot Multiplex Kit試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5延伸產(chǎn)物的純化：使用蝦堿酶進(jìn)行產(chǎn)物純化，加入產(chǎn)物后震蕩混勻，37 ℃保溫1 h，75 ℃保溫15 min滅活SAP酶，4 ℃保存24 h。

1.2.6ABI PRISM 3730測序分析：向96孔板中加入1 μL上述純化延伸產(chǎn)物，與Gene scanTM-120LIZ Size Standard 0.5 μL和去離子甲酰胺8.5 μL混合均勻后，95 ℃變性5 min，直接進(jìn)行3730掃板。

表1　PCR和SNaPshot引物

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有資料使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用不同組別及亞組中性別、年齡等基本特征比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；Hardy-Weinberg遺傳平衡用χ2檢驗(yàn)檢測；χ2檢驗(yàn)比較各組及各亞組基因型頻率和等位基因頻率；比值比(odds ratios，OR)及95%可信期區(qū)間(confidence intervals，CI)用于說明單位點(diǎn)基因突變發(fā)生PD的風(fēng)險(xiǎn)是未突變的倍數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1測序掃描圖見圖1。

圖1從左至右為位點(diǎn)rs36221、rs7077361、rs1491942的測序結(jié)果，依次為T、T、G

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)為檢驗(yàn)3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布是否平衡，分別對(duì)SPD組和對(duì)照組基因型進(jìn)行吻合度檢驗(yàn)。結(jié)果表明：SPD組和對(duì)照組中SNCA(rs356221)、ITGA8(rs7077361)、LRRK2(rs1491942)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，吻合度良好，提示樣本對(duì)總體的代表性良好。

2.3基因型頻率、等位基因頻率分析(1)SNCA(rs356221)位點(diǎn)SPD組與對(duì)照組相比基因型頻率無顯著差異(P=0.398)，等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.139)。(2) ITGA8(rs7077361)位點(diǎn)SPD組與對(duì)照組相比基因型頻率無顯著差異(P=1.000)，等位基因頻率無顯著差異(P=1.000)。(3)LRRK2(rs1491942)位點(diǎn)SPD組與對(duì)照組相比基因型頻率有顯著差異(P=0.008)，等位基因頻率也有顯著差異(P=0.007,OR=0.62，95%CI=0437～0.880)；進(jìn)一步分析CC+GC的累加效應(yīng)，含C等位基因和不含C等位基因在2組間的比較有顯著差異(P=0.003,OR=1.945,95%CI=1.246～3.307)；按年齡將SPD組分為早發(fā)性PD(EOPD，年齡<50歲)和晚發(fā)性PD(LOPD，年齡≥50歲)，與同樣按年齡分層的對(duì)照組相比，EOPD組基因型頻率有顯著差異(P=0.008)，等位基因頻率無顯著差異(P=0.237)，LOPD組基因型頻率有顯著差異(P=0.035)，等位基因頻率有顯著差異(P=0.006,OR=0.549,95%CI=0.358～0.843)；按性別分層對(duì)2組進(jìn)行分析，男性組基因型頻率和等位基因頻率均無顯著差異(P=0.209/0.586)，女性組基因型頻率有顯著差異(P=0.005)，等位基因頻率有顯著差異(P=0.001,OR=0.44，95%CI=0.27～0.715)。見表2。

表2　SNCA(rs356221)、ITGA(rs7077361)、LRRK2

3討論

SNCA基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可位于SNCA的啟動(dòng)子、內(nèi)含子區(qū)域，也可位于SNCA的3’端，rs356221位于SNCA基因的3’端。臺(tái)灣的一項(xiàng)研究[4]發(fā)現(xiàn)rs356221與PD相關(guān)(P<0.02)，2006年日本的一項(xiàng)研究[5]發(fā)現(xiàn)rs356221與PD發(fā)病具有很強(qiáng)的相關(guān)性(P<0.01)，2007年歐洲的一項(xiàng)研究[6]顯示了同樣結(jié)果(P=0.021)，同年愛爾蘭的研究[7]顯示rs356221與PD無相關(guān)性(P=0.32)，本研究結(jié)果同樣顯示rs356221與中國閩南地區(qū)漢族人群SPD無相關(guān)性，至于為什么與亞洲其他地區(qū)特別是和閩南血緣關(guān)系較近的臺(tái)灣地區(qū)的研究結(jié)果不一致，可能需要更大樣本量的研究。

ITGA8是新近發(fā)現(xiàn)的1個(gè)PD相關(guān)基因，位于染色體10p13，其表達(dá)產(chǎn)物為整合素蛋白α-8，為I型轉(zhuǎn)膜蛋白，主要表達(dá)于腦[8]，介導(dǎo)細(xì)胞間相關(guān)作用及運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元的突觸生長[9]。其中多態(tài)性位點(diǎn)rs7077361，在2009年由Simon-Sanchez等[10]發(fā)現(xiàn)與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P= 1.3×10-8)。之后多項(xiàng)對(duì)高加索人進(jìn)行的GWAS研究均發(fā)現(xiàn)rs7077361是這個(gè)區(qū)域與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性最強(qiáng)的基因[11]。但本次研究SPD組未發(fā)現(xiàn)1個(gè)雜合子或突變子，對(duì)照組發(fā)現(xiàn)1個(gè)雜合子，重新審核該研究對(duì)象相關(guān)資料，確認(rèn)無PD家族史，個(gè)人也無PD相關(guān)癥狀。因此，ITGA(rs7077361)基因單核苷酸多態(tài)性可能與中國閩南地區(qū)散發(fā)性帕金森病發(fā)病無關(guān)。

LRRK2基因是目前被鑒定與帕金森病相關(guān)性最強(qiáng)的基因[12]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)與PD相關(guān)的LRRK2基因多態(tài)性位點(diǎn)，2012年美國國立衛(wèi)生協(xié)會(huì)針對(duì)美國及西班牙PD患者進(jìn)行大樣本的LRRK2多態(tài)性位點(diǎn)分型研究，共檢測了66個(gè)常見的多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)SNP與PD相關(guān)[13]，同時(shí)Lill等[14]搜集美、日、英、法等國家的資料進(jìn)行大樣本Meta分析顯示 rs1491942與PD有顯著相關(guān)性(P=6.44×10-15),同年芬蘭針對(duì)年輕PD患者(≤55歲)的一項(xiàng)研究[15]發(fā)現(xiàn)，rs1491942與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性(P=0.367)。趙輝等[16]針對(duì)rs1491942位點(diǎn)在中國淮海地區(qū)搜集了152例晚發(fā)SPD患者和160例對(duì)照，分析結(jié)果顯示與PD相關(guān)(P=0.006)，且C等位基因?yàn)槲ｋU(xiǎn)因素。本研究結(jié)果同樣表明rs1491942多態(tài)性位點(diǎn)與SPD相關(guān)，等位基因C為致病危險(xiǎn)因素，與國內(nèi)研究結(jié)果一致。我們進(jìn)一步對(duì)性別及起病年齡進(jìn)行分層，結(jié)果表明rs1491942與LOPD相關(guān)，與EOPD不相關(guān)，rs1491942與女性組相關(guān)，與男性組不相關(guān)。因此，LRRK2(rs1491942)基因單核苷酸多態(tài)性與中國閩南地區(qū)漢族女性晚發(fā)型散發(fā)性帕金森病發(fā)病相關(guān)，等位基因C可能是其發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

SNP在人基因組中發(fā)生頻率較高，每1 000個(gè)堿基中可能就有1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，用于確定基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系及解釋個(gè)體間表型的差異對(duì)疾病的易感程度，然而其具有種族、地域、環(huán)境差異，本研究結(jié)果也反映了這一點(diǎn)。本研究也可能存在選擇性偏倚，尚需更大樣本量的分析，從而為PD的發(fā)病機(jī)制研究提供更多的基因?qū)W基礎(chǔ)。

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(收稿2014-09-23)