三七皂甙Rb1對急性呼吸衰竭大鼠的影響及作用機制的研究

作者單位：072750 河北省涿州市醫院腫瘤科

三七皂甙Rb1對急性呼吸衰竭大鼠的影響及作用機制的研究

李憶蘭戴富林張杰根武凡

【摘要】目的探討三七皂甙Rb1對急性呼吸衰竭大鼠肺臟線粒體功能的影響及作用機制。方法將Wistar大鼠隨機分為4組，分別為對照組、呼吸衰竭模型組、Rb1治療1組(低劑量組5 mg/kg)、Rb1治療2組(高劑量組10 mg/kg)，每組10只。采用舌靜脈注射內毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)復制大鼠急性呼吸衰竭模型，于大鼠急性呼吸衰竭3小時后，迅速取出大鼠肺臟，低溫差速離心法提取肺臟組織線粒體，用熒光偏振法檢測肺臟線粒體膜的流動性和膜的微粘度。用RT-PCR測定細胞色素氧化酶ⅡmRNA表達的變化，用[3H]油酸標記的大腸桿菌作為底物，測定呼吸衰竭大鼠分泌性磷脂酶A2活性的變化。結果大鼠呼吸衰竭肺臟線粒體膜的流動性下降，呼吸衰竭組線粒體膜細胞色素氧化酶Ⅱ基因表達增強，2小時達高峰。分泌型磷脂酶A2活性1小時增強，5小時達高峰，三七皂甙Rb1低劑量組(5 mg/kg)可使線粒體膜流動性下降，細胞色素氧化酶ⅡmRNA表達增強，三七皂甙Rb1高劑量組(10 mg/kg)與模型組相比有統計學意義(P<0.01)。結論三七皂甙Rb1對呼吸衰竭有保護作用(P<0.05)，其中高劑量組對呼吸衰竭大鼠有顯著的保護作用(P<0.01)。

【關鍵詞】三七皂苷Rb1；急性呼吸衰竭；膜的流動性；細胞色素氧化酶Ⅱ；分泌性磷脂酶A2

基金項目：河北省科學技術研究與發展計劃細化項目(11276103D-6)

作者簡介：李憶蘭(1977- )，女，本科，主治醫師。研究方向：三七皂甙Rb1對急性呼吸衰竭的作用機理。E-mail: 1634772023@qq.com

通訊作者：戴富林(1947- )，碩士，主任醫師。研究方向：急慢性呼吸衰竭的機理研究。E-mail: 1634772023@qq.com

【中圖分類號】R285, R563.8

收稿日期：(2014-12-11)

Research on effect and action mechanism ofPanaxNotoginsengsaponins Rb1 on acute respiratory failure ratsLIYi-lan,DAIFu-lin,ZHANGJie-gen,etal.Oncologydepartment,Zhuozhoucityhospital,Hebei,Zhuozhou072750,China

Abstract【】ObjectiveTo research about the function and funcition mechanism of Panax Notoginseng saponins Rb1 on the mitochondrial of lung of acute respiratory failure rats. MethodsWistar rats were randomly divided into 4 groups, including control group, respiratory failure model group, Rb1 Treatment Group 1 (low dose group of 5mg/kg), Rb1 Treatment Group 2 (high dose group of 10 mg/kg). There were 10 rats in each group. The lipopolysaccharide (LPS) was injected through the lingual. vein to duplicate the acute respiratory failure model of rats. 3h after the acute respiratory failure of rats, the lungs of the rats were quickly removed. After blending with the homogenizer, the low temperature differential centrifugation was used to extract the mitochondria in the lung tissue, and the membrane fluidity of mitochondria was determined. The fluorescence polarization method was used to detect the potential of mitochondrial membrane of the lung membrane fluidity.RT-PCR was used to determine the change of expression of mRNA in Cytochrome Oxidase Ⅱ. Secretory phospholipase A2(sPLA2) activity was tested by labeled E.coli membrane with[3H]oleic acid as substrate to determine the change of the activity of secretory phospholipase A2 of respiratory failure rats. ResultsAcute respiratory failure model of rats lung mitochondria decreased.The gene expression of cytochrome oxidaseⅡ was enhanced, and reached the peak after 2h. The membrane fluidity and the micro viscosity of membrane decreased. The activity of secretory phospholipase A2 was enhanced after 1h, and reached the peak after 5h. After the treatment with Panax Notoginseng saponins Rb1 of 5mg/kg, the expression of mRNA of cytochrome oxidase Ⅱ could be inhibited. 10 mg/kg of Rb1 has statistical significance compared with the model group. ConclusionThe high dose group of Panax Notoginseng saponins Rb1 has significant protective effect on the respiratory failure rats.

【Key words】Panax Notoginseng saponins Rb1;Respiratory failure;Membrane fluidity;Cytochrome oxidaseⅡ;Secretory phospholipase A2

三七總皂甙(Panax Notoginseng saponins, PNS)是中藥三七的主要有效成分，在心血管系統、呼吸系統、神經系統及免疫系統等多方面具有良好的藥理作用，臨床應用廣泛，具有良好的新藥開發價值。其中，三七皂甙R1、人參皂苷Rg1和三七皂甙Rb1是公認的代表性成分。陸燕等[1-2]認為三七總皂甙及其主要成分Rg1、Rb1等對急性呼吸衰竭有一定的保護作用。目前對三七皂甙Rg1的研究很多，但是對三七皂甙Rb1的研究甚少，而且機制尚不明確。嚴重感染、創傷、休克后，常出現以呼吸窘迫和低氧血癥為特征的一種急性進行性呼吸困難，為臨床常見的危重癥之一，死亡率很高，急性肺損傷嚴重威脅人類健康，是目前醫學界研究的一個熱點。本試驗采用舌靜脈注射內毒素脂多糖復制大鼠急性呼吸衰竭模型，用熒光偏振法檢測肺臟線粒體膜電位和膜的微黏度。用RT-PCR測定細胞色素氧化酶(cytochrome oxi-dase, COX)ⅡmRNA表達的變化，用[3H]油酸標記的大腸桿菌作為底物，測定急性呼吸衰竭大鼠分泌性磷脂酶(secretory phospholipase, sPL)A2活性的變化。從三七皂甙Rb1對急性呼吸衰竭的影響方面入手，旨在為研究三七皂甙Rb1治療呼吸系統疾患，特別是急性呼吸衰竭提供盡可能詳盡的實驗依據和理論基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑

三七皂甙Rb1購自昆明植物研究所。Hepes、IV型膠原酶、胰蛋白酶抑制劑、Percoll、均購于sigma公司。

1.2實驗動物

雄性Wistar大鼠40只，體質量(200±10)g，動物購自河北醫科大學動物實驗中心，合格證號：翼醫動字號04056。

1.3動物模型的制作

健康Wistar大鼠40只隨機分為4組：正常對照組、呼吸衰竭模型組、Rb1低劑量組(5 mg/kg)、Rb1高劑量組(10 mg/kg)，每組10只。采用舌靜脈注射內毒素脂多糖復制大鼠急性肺損傷模型，于大鼠急性肺損傷3小時后給予Rb1治療3小時，斷頭放血處死。

1.4標本采集

4組大鼠按不同指標所需時間從尾靜脈收集血液分離血清，放置-20℃儲存。迅速取出大鼠肺臟，低溫差速離心法提取肺臟組織線粒體，測定線粒膜的流動性及膜的微黏度，測定sPLA2活性的變化，測定COXⅡ的表達。

1.5線粒體膜流動性的測定

取新鮮肺臟組織，按照文獻[3]并加以改進，用差速離心法獲得線粒體，將線粒體懸浮在1.5 mL分離遞質中，卡馬氏蘭測定蛋白質含量使蛋白質濃度為5 mg/mL，采用熒光標記與熒光偏振法，激發光波362 nm，發射光波長432 nm，在熒光分光度計上(加偏振片)測定膜熒光偏振度(P)，按公式η=2p/0.46-P，求出平均微粘度，用于膜流動性的測定。

1.6COXⅡ表達的測定

1.6.1引物的合成 參照文獻[4]細胞色素氧化酶Ⅱ(COXⅡ)上游引物序列：TCGACCCCCTACAACTGGTTTCAAGG，下游引物序列：AAATCATGTGGATGTGTCTAGTTGTGGC；β-actin(管家基因)上游引物序列：AAATCGTCGGTGACATCAAA，下游引物序列：ATCGTACTCGTGCTTGCTGA。

1.6.2總RNA的分離 應用Tripure isolation reagent(Roche)分離細胞總RNA，按說明書要求操作。

1.6.3RT-PCR檢測 COXⅡmRNA的變化應用日本寶生物公司TaKaRa RT-PCR Kit(AMV)檢測，按要求操作。瓊脂糖凝膠電泳檢測：紫外燈下觀察，凝膠成像系統掃描存盤。記錄各條帶積分光密度(IOD)，將各個檢測基因與自身β-actin條帶IOD相比較得到其相對IOD。

1.7sPLA2活性的測定：

參照文獻[5]制備的[3H]油酸標記的大腸桿菌為sPLA2的底物。測定時取上清液100 μL加閃爍液6 mL，避光靜置12小時作液閃計數。sPLA2單位定義：以每升樣品37℃每分鐘水解1 nmol磷脂量為1個單位。

1.8統計學分析

2結果

2.1Rb1對大鼠肺臟線粒體膜流動性的影響

試驗結果顯示大鼠急性呼吸衰竭后，可使肺臟線粒體膜損傷，破壞膜磷脂層。線粒體腫脹，膜流動性降低，膜的微黏度增加。三七皂甙Rb1高、低劑量組治療后，可明顯提高線粒體膜流動性，降低膜的微粘度，與呼衰組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1　Rb1對大鼠肺上皮細胞線粒

注：與對照組比較，aP<0.01；與呼衰組比較，bP<0.01；與Rb1低劑量組比較，cP<0.05

2.2Rb1對大鼠肺臟線粒體COXⅡmRNA表達的影響

觀察急性呼吸衰竭大鼠肺臟線粒體COXⅡmRNA的表達變化，COXⅡ基因表達1小時開始逐漸增強，2小時表達最強，達到高峰，隨著呼吸衰竭時間延長，表達又逐漸減弱，呼吸衰竭晚期5小時表達顯著低于正常對照組(P<0.01)；Rb1低劑量組(5 mg/kg)治療后，可使COXⅡmRNA表達增強(P<0.01)。Rb1高劑量組(10 mg/kg)治療后，與對照組相比，表達有顯著性差異P<0.01。

呼吸衰竭大鼠1小時COXⅡ的表達量是(1.40±0.04)開始逐漸增加，2小時達高峰，2小時是(3.08±0.03)，維持到3～4小時后其表達量逐漸減少，3小時是(1.22±0.03)，5小時后明顯低于對照組。5小時是(0.54±0.02)，對照組是(1.23±0.03)，Rb1高劑量組5小時其表達量與對照組相比有顯著性差異。(P<0.01)。見表2。

2.3Rb1對大鼠肺臟線粒體sPLA2活性的影響

急性呼吸衰竭組大鼠肺臟線粒體sPLA2于1小時內迅速增加，其活性為172.55 U/L，于第3小時達高峰，其活性為214.22 U/L，自此平緩下降，第5小時活性最低，為162.77 U/L，sPLA2活性與對照組

表2　各組大鼠肺上皮細胞線粒體編碼基因COXⅡ表達的變化 ±s，n=10)

注：與對照組比較，aP<0.01；與Rb1高劑量組比較，bP<0.05

表3　呼吸衰竭大鼠肺臟線粒體sPLA2活性時向性變化

注：與對照組比較，aP<0.01；低劑量和高劑量組與呼衰組比較，bP<0.01。Rb1低劑量組與Rb1高劑量組相關性比較r=0.945(P<0.01)

相比，P<0.01，低劑量和高劑量組與呼衰組比較P<0.01，Rb1低劑量組與Rb1高劑量組相關性比較r=0.945(P<0.01)。Rb1高劑量組sPLA2活性明顯低于相應的Rb1低劑量組。實驗結果顯示，與對照組相比，大鼠急性呼吸衰竭導致sPLA2活性明顯增加(P<0.01)，三七皂甙Rb1低劑量組與高劑量組顯著抑制sPLA2的活性，三七皂甙Rb1低劑量組與高劑量組有明顯的相關性，其Rb1高劑量組sPLA2的活性明顯低于相應的Rb1低劑量組。見表3。

3討論

線粒體膜電位是指存在于生物膜兩側的電位差，是評價線粒體膜非常敏感的指標，本研究檢測到急性呼吸衰竭大鼠線粒體膜的流動性明顯下降，其差異與對照組相比均有統計學意義(P<0.01)，提示損傷急性呼吸衰竭大鼠肺臟線粒體膜嚴重損傷，導致線粒體膜剛性增加，流動性下降，本實驗采用熒光偏振法，以DPH作為熒光探針標記線粒體膜以測定線粒體膜的流動性，熒光偏振度大，膜流動性小；反之，熒光偏振度小，膜的流動性大。本試驗與模型組相比，三七皂甙Rb1低劑量組和高劑量組降低呼吸衰竭大鼠微黏度，提高膜的流動性(P<0.01)，保護了線粒體膜的完整性，推測對線粒體的功能會產生影響。急性呼吸衰竭是一非常復雜的過程，研究發現[6]在內毒素介導的肺損傷情況下，肺組織內可產生大量自由基，而膜上富含不飽和脂肪酸的線粒體則成為自由基攻擊的主要靶點，這其中包括線粒體膜腫脹、線粒體膜流動性降低、膜的微黏度增高、酶活性降低。

測定急性呼吸衰竭時sPLA2活性的時相性變化。本實驗采用[3H]油酸標記的大腸桿菌為sPLA2的底物。sPLA2的激活對Ca2+有高度依賴性，sPLA2激活后可在Sn-2位酯酰鍵處水解膜磷脂，引起細胞膜的損害，導致細胞膜通透性增加，進一步加重Ca2+升高，使胞內Ca2+轉運失控，線粒體內代償性Ca2+蓄積，磷脂酶A2水解甘油磷酸酯的Sn-2位脂肪酸酰脂鍵，產生游離的花生四烯酸和溶血卵磷脂。Maniatis等報道[7]，在正常情況下，磷脂酰絲氨酸(PS)位于磷脂雙分子層的內側不易被sPLA2水解。當線粒體受損時，線粒體膜分子重排，磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在胞膜外側，而sPLA2水解的最適底物為磷脂酰絲氨酸(PS)，因此sPLA2迅速水解磷脂酰絲氨酸(PS)產生并釋放溶血卵磷脂和花生四烯酸，加重了線粒體肺臟的損害，而線粒體損害使sPLA2活性進一步增高，Robertson等[4,8]認為，sPLA2在肺損傷時這個級聯反應中處于關鍵位置。本實驗支持Robertsone等學者的觀點，在急性呼吸衰竭第3小時sPLA2急劇增加達高峰，陸燕等[1-2]認為三七皂甙Rb1對呼吸衰竭大鼠肺臟線粒體有一定的保護作用，但機理尚不清楚，本實驗認為sPLA2在急性呼吸衰竭中是負有責任的。本實驗進一步研究發現，三七皂甙Rb1低劑量組和高劑量組可明顯抑制sPLA2的活性(P<0.01)。且三七皂甙Rb1低劑量組與高劑量組有明顯的相關性(P<0.01)，提示三七皂甙Rb1劑量增加會減低sPLA2的活性，對急性呼吸衰竭有顯著防護作用。

Amet等[8]報道，急性呼吸衰竭可使細胞色素氧化酶COXⅡ表達紊亂，mtDNA受損，其機制可能是在翻譯水平熱休克蛋白擾亂了mtDNA在轉錄水平的表達。急性呼吸衰竭上皮細胞線粒體損傷與氧化磷酸化(oxidative phosphorylation OXPHOS)功能障礙有關。COXⅡ是線粒體呼吸鏈過程中的氧化還原的關鍵酶，其損傷可直接影響線粒體功能。本實驗研究發現，呼吸衰竭大鼠1小時后COXⅡ表達增加，2小時后COXⅡ達高峰，維持到3小時mRNA穩定表達，在呼吸衰竭早期COXⅡ表達增加，引起線粒體基因增加的途徑大部分仍不清楚，Ang等認為，線粒體能量供應的受損可引起線粒體基因表達的增加，這是一種可能的代償機制[10-11]。本實驗結果觀察到三七皂甙Rb1使COXⅡ的表達明顯下降，使維持到3小時的mRNA穩定的表達，減輕了COXⅡ引起的急性呼吸衰竭的損傷。使用Rb1低劑量或高劑量Rb1后可以使線粒體功能結構損害有所減輕，并改善了線粒體呼吸鏈的功能，使線粒體呼吸鏈得以正常發揮，從而保護了線粒體，并提高了抗急性呼吸衰竭的能力。保證了線粒體的正常氧化和產能功能，改善了內毒素引起的急性肺損傷。

本課題前期實驗認為[9, 13]，在急性呼吸衰竭晚期細胞缺氧使線粒體不能獲取足夠的氧進行氧化磷酸化，同時線粒體結構功能受損，細胞能量生成發生障礙，細胞能量嚴重不足，導致線粒體膜電位崩潰，呼吸鏈解偶聯，ATP合成停止，細胞ATP耗竭，不能對細胞損害進行有效修復。

有報道提出Rb1增強急性呼吸衰竭后線粒體抗氧化作用[12]，保護線粒體形態與功能的完整，改善線粒體能量代謝可能是其治療急性呼吸衰竭的重要作用機制。

本項目證實三七皂甙Rb1增加膜的流動性(P<0.01)，降低膜的微黏(P<0.01)，降低細胞色素氧化酶COXⅡ的表達，在防止急性肺損傷中起重要作用，其中高劑量組與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)，說明高劑量Rb1組對急性呼吸衰竭有較好的保護作用，本實驗表明三七皂甙Rb1高劑量組與低劑量組是通過降低膜的微粘度，提高膜的流動性，降低sPLA2的活性，降低COXⅡ的表達而防止大鼠急性呼吸衰竭，本項目對開發三七皂甙單體Rb1(高、低劑量組)防止臨床急性呼吸衰竭提供盡可能詳盡的實驗依據和理論基礎。

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(本文編輯：黃凡)