正交型發光二極管誘導熒光檢測器的研制

（北京理工大學，北京100081）

熒光檢測技術具有靈敏度高、選擇性強的特點，其中激光誘導熒光檢測器（laser induced fluorescence detection，LIFD）采用方向性和單色性能極佳的激光作為激發光源，能夠達到超高的檢測靈敏度（10－13mol·L－1）［1］。在基質復雜的生物樣品分析中，只有自發熒光或熒光衍生化的物質能夠產生熒光信號，可以有效降低甚至消除基質對檢測結果的干擾，具有很高的選擇性。

然而，激光誘導熒光檢測器的小型化對于研究人員來說卻是一個重大的挑戰。商品化儀器主要用傳統的氣體激光器，具有價格昂貴、體積大、功耗高的缺點［2］，嚴重限制其廣泛應用，半導體激光器的采用使這一情況有所改善，但并未從根本上解決這一問題。另外，為了降低背景噪聲，提高檢測靈敏度，常規激光誘導熒光檢測裝置都配備了復雜的光學系統，導致其體積非常龐大，也很難滿足小型化的要求，因此，采用低功耗的激發光源并簡化光路設計已經受到越來越多研究人員的重視。近年來，一些低功耗、小型化的激發光源逐漸應用到了熒光檢測中［3－6］。發光二極管（lightemitting diode，LED）具有價格低、功耗低、體積小、可選波長范圍寬、壽命長等優點［2，7－9］，可以實現儀器微型化和廉價化，在諸多研究中已經得到應用。在光學系統優化方面，光纖扮演了重要的角色，具有數值孔徑大、柔韌性好、可以使光線進行曲線傳播等特點，代替復雜的透鏡組，使得儀器變得非常簡潔、緊湊［2，9－14］。LED 作為一種非相干光源，具有很大的發散角，而通常選用的光纖直徑多為幾百甚至幾十微米，因此提高LED 發散光與光纖的耦合效率是提高檢測靈敏度的關鍵。為了降低柱外效應的影響，檢測器的檢測池通常在微升或納升級別，對于小型分析系統來說則需要更小的體積，這就對光纖與檢測池的耦合以及裝配精度提出了極高的要求，任何環節出現微小的偏差都可能導致檢測靈敏度顯著下降。

作者報道了一種體積小、功耗低、裝配簡單的小型LED 誘導熒光檢測器，采用正交型光學系統，以LED作為激發光源，研制了高精度加工的光纖－毛細管自校準平臺以及光電轉換和信號采集模塊，基于Lab－VIEW 圖形化編程語言開發了上位機程序。以熒光素鈉為目標化合物，對檢測器性能進行了評價，優化了氨基酸的衍生化方法，并進行了異硫氰酸熒光素（FITC）衍生化氨基酸的分離檢測。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

熒光素鈉，分析純，北京拜爾迪生物公司；硼酸、硼砂，分析純，北京化學試劑公司；甲醇，色譜純，Sigma；實驗用水為超純水。

RIGOL L－3000型高效液相色譜儀；LED（LXmL－PR01－0225，中心發射波長465～470nm，5 V，700 mA），鈞智科技有限公司；R－003型準直透鏡，昴氏（上海）電子貿易有限公司；H5784型光電倍增管，濱松光子學商貿（中國）有限公司；多模光纖（N.A＝0.29，芯徑100μm，外徑140μm），北京星源奧特光電技術有限公司；濾光片（sp485短通濾光片和lp515長通濾光片），北京京儀博電光學技術有限責任公司；47－221型光纖準直器，愛特蒙特（深圳）光學有限公司。

1.2 正交型LED誘導熒光檢測器的研制

1.2.1 光路設計

檢測器采用正交型光路設計，如圖1所示。

圖1 正交型光路結構示意圖Fig.1 Structure diagram of orthogonal optical arrangement

LED 的散射光經準直透鏡準直成平行光，由光纖準直器耦合進入100μm 芯徑的多模光纖，并傳導至檢測窗口，射入作為檢測池的100μm 內徑的熔融石英毛細管中。激發的熒光由垂直方向的熒光透鏡收集，經過長通濾光片濾去波長小于510nm 的雜散光，最終到達光電倍增管進行光電轉換。為避免激發光進入光電倍增管造成背景水平升高，在光纖準直器之前和熒光收集透鏡之后分別配置了短通和長通濾光片。

1.2.2 系統實現

(1) 微網運行控制技術 與傳統的電力系統控制技術不同,微網側重并、離網控制技術(分布式電源控制技術有下垂控制技術、v/f控制技術、p/v控制技術)。此外,微網整體運行控制也是微網領域的熱點和趨勢。

研制的LED 誘導熒光檢測器采用模塊化設計，主要包括LED 光纖光源、光纖－毛細管自校準平臺、信號采集卡和上位機程序。圖2為集成的正交型LED 誘導熒光檢測器原理樣機。

1.2.2.1 LED 光纖光源設計（圖3）

光纖光源主要包括：高亮度LED 燈及其配套的準直透鏡，二者通過LED 電路板的定位孔安裝在一起。連接件中安裝有短通濾光片，通過螺紋與外殼裝配，并將LED 燈與準直透鏡固定在外殼中。準直透鏡一端安裝在連接件的上端，另一端連接SMA 接口的多模光纖。LED 光纖光源外殼為散熱性能良好的鋁制材料，LED 電路板采用鋁基板，可將LED 燈產生的熱量散發到外界環境，保持LED 燈發光功率的穩定。

圖2 正交型LED誘導熒光檢測原理樣機Fig.2 Principle prototype of LED induced fluorescence detector based on orthogonal optical arrangement

圖3 LED光纖光源結構示意圖Fig.3 Structure diagram of LED fiber light source

1.2.2.2 光纖－毛細管自校準平臺設計（圖4）

采用高精度機械加工，在平臺上形成2條截面為U 型的定位槽（圖4a），基準軸2和3所指的定位槽分別放置毛細管（外徑375μm）和光纖（外徑140μm），深度分別為285μm 和170μm，底部圓形直徑分別為375μm 和140μm；基準軸1為垂直方向的熒光收集透鏡中心軸。放置于對應定位槽內的光纖和毛細管與U 型槽的圓形底部完全匹配，并且二者的中心軸互相垂直相交于f點（圖4b），f點也是熒光收集透鏡的焦點，從而實現光纖－毛細管的自校準，同時使熒光檢測窗口處于熒光收集透鏡的焦點位置，在不使用輔助校準設備的前提下，實現三者中心軸互相垂直相交，達到最佳的熒光激發和收集效率。

1.2.2.3 信號采集卡設計

硬件電路主要包括LED 燈和PMT 供電電源模塊、熒光信號采集模塊和RS232串口通訊模塊，其中熒光信號采集模塊最為重要。本設計采用模數轉換芯片AD7734將光電倍增管傳輸的模擬信號轉換為數字信號，由微處理器MSP430F449 進行數據處理，通過RSR232串口與上位機進行數據傳輸。

本設計基于LabVIEW 圖形化編程語言編寫了用于數據顯示和處理的工作站軟件，包括兩大模塊：在線數據采集模塊和離線數據分析模塊。其中在線數據采集模塊可以進行串口配置、數據實時采集與顯示、數據保存；離線數據分析模塊可以進行歷史數據載入、數據處理并生成報表。

圖4 光纖－毛細管自校準平臺及激發部位結構示意圖Fig.4 Self－calibration platform of optical fiber and capillary tube and structure diagram of excitation part

1.3 檢測器性能測試

以熒光素鈉為目標化合物，通過自動進樣器將熒光素鈉引入流路，由液相色譜泵驅動進入檢測池（由于只需測定檢測性能，并未涉及到分離，所以未連接色譜柱）。流動相：20×10－6mol·L－1硼酸鹽緩沖溶液（pH 值9.37）；流速：1mL·min－1；進樣量：20μL。

1.4 氨基酸分離檢測

色譜條件：RIGOL L－3000型高效液相色譜系統，Diamonsil C18反相色譜柱，進樣量20μL，流動相為甲醇－硼酸鹽緩沖溶液（pH 值9.37）（30∶70，體積比）。

氨基酸衍生化和HPLC 分離檢測：在避光條件下，取100μL甘氨酸溶液置于10mL容量瓶中，加入適量的FITC溶液，振蕩混勻，用pH 值為9.37 的硼酸鹽緩沖溶液定容至10mL，在特定溫度下孵育一定時間，待用。

將衍生化的氨基酸進行HPLC 分離檢測，在每次實驗完成后調整流動相比例為80%甲醇將未洗脫的FITC沖出再進行下一次分析。由于FITC 與氨基酸必須在高濃度下反應才能得到較高的產率，在進行高效液相色譜分析前，需要對樣品進行適當稀釋，用0.22μm濾膜過濾后再進樣分析。

2 結果與討論

2.1 檢測器性能測試結果

2.1.1 溶液pH 值對熒光素鈉熒光強度的影響

熒光素鈉作為黃綠光區中的一種熒光染料，具有較高的能量轉換效率，并且其熒光強度與其溶液的pH 值直接相關，因此在測試熒光檢測器性能前有必要對溶液pH 值與熒光素鈉熒光轉換效率的關系進行考察。采用流動注射模式，在不同pH 值流動相條件下對1×10－7mol·L－1的熒光素鈉進行檢測，記錄其色譜峰面積（n＝5），結果如圖5所示。

圖5 不同pH 值下熒光素鈉的熒光響應Fig.5 Fluorescent response of sodium fluorescence at different pH values

由圖5可以看出：在酸性和弱堿性環境中，熒光素鈉產生的熒光強度較低；隨著pH 值的增大，熒光強度逐漸增強，在pH 值為9.37 時達到最強；但是當pH值增大到10以后，熒光強度呈減弱趨勢。

2.1.2 性能測試

配制系列濃度的熒光素鈉溶液，采用流動注射模式，在同一實驗條件下分別進樣5次，進行性能測試，得到最低檢測量為1.02ng、最低檢測限為6.75×10－8mol·L－1（S／N＝3），檢測系統在1.35×10－7～43.2×10－7mol·L－1范圍內線性關系良好，線性方程為y＝0.1525x－15.669，R2＝0.9992。

圖6為1.35×10－7mol·L－1熒光素鈉的HPLC圖譜。

圖6 1.35×10－7 mol·L－1熒光素鈉的HPLC圖譜Fig.6 HPLC of 1.35×10－7 mol·L－1 sodium fluorescence

2.2 檢測器穩定性測試結果

分別將熒光素鈉供試品溶液連續進樣5次，記錄色譜峰，以峰面積考察檢測器穩定性，結果見表1。

表1 LED誘導熒光檢測器的穩定性測試結果Tab.1 Stability testing results of LED induced fluorescence detector

由表1可知，RSD 值小于1，表明該檢測器穩定性良好。

2.3 氨基酸衍生化條件的選擇

2.3.1 FITC與氨基酸物質的量比對衍生化的影響

FITC與氨基酸物質的量比是影響衍生物產率的重要因素之一。本實驗選用甘氨酸（Gly）與FITC 反應來考察不同物質的量比對衍生反應的影響，將FITC溶液與甘氨酸溶液分別按物質的量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1、10∶1混合，室溫下避光反應24h后進行高效液相色譜檢測，以FITC－Gly衍生產物峰面積對FITC 與甘氨酸物質的量比作圖，結果見圖7。

圖7 FITC與甘氨酸物質的量比對衍生化的影響Fig.7 Effect of the molar ratio of FITC to Gly on derivatization

由圖7可以看出，FITC與甘氨酸物質的量比從1∶1增大到5∶1時，峰面積逐漸增大，繼續增大物質的量比，峰面積變化很小。因此，選擇最佳的FITC 與氨基酸的物質的量比為5∶1。

2.3.2 反應溫度與反應時間對衍生化的影響

化學反應速率除與反應物本身的性質相關外，外界因素（如溫度、濃度、催化劑等）也會對其產生影響。

本實驗考察了反應溫度與反應時間對衍生化反應的影響。按照FITC與甘氨酸物質的量比5∶1配制反應液，采用高效液相色譜法在特定時間測定FITCGly衍生產物的峰面積，以不同溫度的峰面積對時間作圖，結果見圖8。

圖8 反應溫度和反應時間對衍生化的影響Fig.8 Effects of reaction temperature and reaction time on derivatization

由圖8可以看出：0 ℃和20 ℃下的FITC－Gly衍生產物峰面積遠小于37 ℃和60 ℃；37 ℃和60 ℃下最終的衍生產物的峰面積相差不大；60 ℃反應4h，衍生產物的峰面積就可以達到最大值，而37℃需要反應24h。考慮到FITC 在較高溫度下穩定性較差，副產物增多，選擇37 ℃孵育。

2.4 衍生化氨基酸的分離

采用高效液相色譜法分離4種FITC 衍生化的氨基酸，實驗分別采用3種流動相甲醇－水（20∶80）、甲醇－磷酸鹽緩沖溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值為8.0）（30∶70）和甲醇－硼酸鹽緩沖溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值為9.37）（30∶70）進行等濃度洗脫，分離衍生化氨基酸。結果發現，用甲醇－硼酸鹽緩沖溶液作流動相，衍生化的氨基酸與游離FITC 可以得到基線分離，如圖9所示。

3 結論

研制了一臺基于正交型光路設計的LED 誘導熒光檢測器，以LED 代替激光器作為激發光源，在光學系統中引入光纖代替透鏡組，使整機的體積和功耗大大降低。采用流動注射模式，以熒光素鈉為目標化合物對檢測器進行了性能評價。結果表明，該熒光檢測器靈敏度和線性范圍可以滿足常規檢測需要，相對于常規激光誘導熒光檢測器，具有小型化、成本低、光學結構簡單的特點，易于裝配和使用。

圖9 衍生化氨基酸的分離Fig.9 Separation of derivative amino acids

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