電子煙煙氣捕集液對CHO細胞相對增殖率的影響

（云南中煙工業有限責任公司，云南昆明650024）

電子煙煙氣是通過電子煙霧化器加熱電子煙煙油產生的如香煙一樣的煙氣。該煙氣產生的原理和成分都與卷煙有著很大差別，因此對電子煙煙氣的生物學效應進行評價十分必要。研究表明，電子煙煙氣的主要成分有丙二醇、甘油、尼古丁、乙醛等一些易溶于水的化合物［1－2］，而目前關于電子煙煙氣引起的生物學效應的報道比較少。鑒于此，作者采用細胞培養基對電子煙煙氣的水溶性成分進行捕集，通過MTT 法研究電子煙煙氣捕集液對體外培養的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的相對增殖率的影響，以期為電子煙研發提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

電子煙樣品，自制。1＃～3＃電子煙樣品的煙堿含量（mg·mL－1）分別為18、12、8；陰性對照為以滅菌蒸餾水為煙油的電子煙；陽性對照為肯塔基大學參比卷煙3R4F。

CHO 細胞，ATCC；DMEM／F12 培養基、胎牛血清，Gibco；MTT，Sigma。

SM450型20 孔道直線式吸煙機，CERULEAN；HFsafe－1500型二級生物安全柜；3111 型CO2培養箱，Thermo Forma；680型酶標儀，Bio－Rad。

1.2 方法

1.2.1 電子煙與3R4F的煙氣捕集

將4.5 mL 不加血清的細胞培養基DMEM／F12加入已滅菌的“一種用于電子煙煙氣生物學效應評價的煙氣捕集裝置”的煙氣捕集瓶中，將直線式吸煙機煙氣來路膠管緊密連接于捕集裝置的煙氣進氣口上；將捕集瓶的煙氣出口與吸煙機回路緊密連接；按照加拿大Labstat電子煙抽吸模式（抽吸容量55 mL，間隔30s，頻率4s）設定自動吸煙程序［3］；每支電子煙抽吸100口，陰性對照抽吸100口，陽性對照3R4F 抽吸一支（電子煙是經霧化器對電子煙煙油進行霧化，不需要點燃，3R4F需要點燃）。

1.2.2 煙氣濃度的設定

將收集到的電子煙煙氣捕集液4.5mL 轉移至離心管內，加入0.5mL 胎牛血清，設定其為100%煙氣濃度（原液）；用含有10%胎牛血清的DMEM／F12細胞培養基將原液分別稀釋至50%煙氣濃度、25%煙氣濃度、12.5%煙氣濃度、6.25%煙氣濃度。

將收集到的3R4F煙氣捕集液按相同方法設定濃度［4］。

1.2.3 MTT 實驗

將CHO 細胞在37 ℃、5%CO2培養箱中培養至細胞生長達到近匯合，且細胞處于指數分裂期。移除培養瓶中的培養基，加入適量胰蛋白酶溶液孵育約1 min，用細胞生長培養基懸起，形成單細胞懸浮液。用血球計數板進行細胞計數，計算每毫升細胞懸浮液中的活細胞數，用細胞生長培養基稀釋細胞懸浮液，使CHO 細胞濃度達到0.8×105～1.2×105個·mL－1。將細胞懸浮液接種到96 孔細胞培養板中，每孔接種量為100μL，置于37℃、5%CO2培養箱內培養24h。

移除96 孔細胞培養板內的培養基，將200μL 煙氣濃度分別為100%、50%、25%、12.5%和6.25%的煙氣捕集液加入96孔板中，每個濃度設8個平行；置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養24h。按常規方法進行MTT 實驗［5］，按下式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：

式中：ODn為樣品組的多孔平均吸收值；OD0為空白對照組的多孔平均吸收值；ODc為陰性對照組的多孔平均吸收值。

1.2.4 數據分析

每個實驗均重復3次，實驗數據用均數±標準差（珚x±s）表示，結果采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，同一樣品不同濃度之間差異比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）［6］，不同樣品不同濃度之間差異采用獨立樣本T檢驗分析，以P＜0.05為有顯著差異。

2 結果與討論

2.1 電子煙和3R4F煙氣捕集液濃度對CHO 細胞相對增殖率的影響（圖1）

圖1 煙氣捕集液對CHO 細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effect of cigratte smoke in cell culture medium on RGR of cell CHO

由圖1可看出：1＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.42倍（圖1a）；2＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.32倍（圖1b）；3＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.27 倍（圖1c）。可見，隨著3種電子煙煙氣稀釋倍數的增大，CHO 細胞的相對增殖率均相應升高。

采用SPSS13.0軟件對1＃、2＃、3＃電子煙煙氣捕集液對CHO 細胞相對增殖率的影響進行統計學分析。結果發現，同一樣品不同濃度之間存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖1d可看出：隨著3R4F 煙氣稀釋倍數的增大，CHO 細胞的相對增殖率相應升高；3R4F 煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的16.67倍。

采用SPSS13.0軟件對3R4F煙氣捕集液對CHO細胞相對增殖率的影響進行統計學分析。結果發現，同一樣品不同濃度之間存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 電子煙和3R4F煙氣捕集液的CHO 細胞相對增殖率的比較（表1）

表1 電子煙和3R4F煙氣捕集液的CHO 細胞相對增殖率的比較（珔x±s，n＝3）Tab.1 Comparison of RGR of cell CHO for electronic cigratte smoke and 3R4Fsmoke in cell culture medium（珔x±s，n＝3）

由表1 可知：3 種電子煙和3R4F 煙氣捕集液對CHO 細胞相對增殖率的影響有顯著差異（P＜0.05）；3種電子煙之間沒有顯著差異（P＞0.05）；在100%煙氣濃度下，電子煙煙氣捕集液的CHO 細胞相對增殖率是3R4F 的10 倍以上，其中，1＃為13.7 倍，2＃為14.6倍，3＃為15.2倍。

3 結論

在加拿大Labstat電子煙抽吸模式下，分別抽吸100口電子煙和一支3R4F，用4.5mL 的細胞培養基捕集煙氣后染毒CHO 細胞進行MTT 實驗。結果表明：抽吸一支3R4F的煙氣捕集液對CHO 細胞相對增殖率的影響明顯大于抽吸100口電子煙煙氣捕集液產生的影響；在100%煙氣濃度下，電子煙煙氣捕集液的CHO 細胞相對增殖率是3R4F 的10倍以上。表明，該方法用于檢測電子煙煙氣捕集液對細胞相對增殖率的影響是可行的，可為電子煙研發提供參考。

［1］LEADBEATER J，LINDSAY J C.Technical review and analysis of FDA report：Evaluation of e－cigarettes［Z］.Technical Memorandum，2009－07－30.

［2］Materials characterization report［Z］.ANALYZE，2007－06－28.

［3］McAULEY T R，HOPKE P K，ZHAO J.Comparison of the effects of e－cigarette vapor and cigarette smoke on indoor air quality［J］.Inhalation Toxicology，2012，24（12）：850－857.

［4］ROMAGNA G，ALLIFRANCHINI E，BOCCHIETTO E，et al.Cytotoxicity evaluation of electronic cigarette vapor extract on cultured mammalian fibroblasts（ClearStream－LIFE）：Comparison with tobacco cigarette smoke extract［J］.Inhalation Toxicology，2013，25（6）：354－361.

［5］YQ／T 42－2013.煙草及煙草制品煙氣安全性生物學評價MTT細胞毒性法［S］.

［6］王立芹，楊俊英，唐龍妹，等.單因素重復測量設計的方差分析及SAS與SPSS的實現［J］.華北煤炭醫學院學報，2005，7（1）：17－19.