紫外－氯化鋰復合誘變選育高產α－淀粉酶菌株

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京210009）

α－淀粉酶（α－1，4－葡聚糖－4－葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1）屬于內切酶，它能作用于淀粉分子內部的α－1，4糖苷鍵，將其水解成糊精、麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等［1］。α－淀粉酶作為酶制劑的重要組成部分，占酶制劑市場約25%的份額，廣泛應用于食品、發酵、紡織、造紙、制藥以及臨床醫學等多個領域［2］。伴隨國內外淀粉加工業的不斷發展，α－淀粉酶的應用范圍還在不斷擴大［2］。因此，篩選高產α－淀粉酶菌株已成為酶制劑研究領域的重要方向。

野生菌株因產率低、性能差而不能直接用于工業化生產，需要通過菌種誘變選育出高產優良菌株［3－7］。不同的誘變方法對菌株會產生不同的突變效應，如紫外誘變可使DNA 形成嘧啶二聚體，氯化鋰誘變可使AT－GC堿基對發生轉換或導致堿基缺失［8－9］。單一誘變方法雖可得到高產菌侏，但幾率偏低；復合誘變具有協同效應，比單一誘變效果好［10］。鑒于此，作者在此采用紫外－氯化鋰對枯草芽孢桿菌BL01 進行復合誘變，以期得到高產α－淀粉酶菌株，對誘變條件進行了優化，并對高產菌株的遺傳穩定性進行了研究。

1 實驗

1.1 菌株與培養基

枯草芽孢桿菌BL01，自行篩選保藏。

LB培養基：蛋白胨10g·L－1，酵母提取物5g·L－1，氯化鈉10g·L－1，pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養基需加入20g·L－1的瓊脂；篩選培養基需加入1%可溶性淀粉；氯化鋰平板培養基需加入一定濃度的氯化鋰。

發酵培養基：可溶性淀粉60g·L－1，豆餅粉30g·L－1，（NH4）2SO45g·L－1，Na2HPO4·12H2O 5g·L－1，MgSO4·7H2O 0.1g·L－1，NaCl 0.1g·L－1，pH 值7.0，121 ℃滅菌20min。

1.2 培養條件

斜面／平板培養：37 ℃培養箱中培養1～2d。

種子液培養：挑單菌落接種到30 mL LB 培養基中，于37 ℃、200r·min－1搖床培養12h。

發酵液培養：搖瓶裝量50 mL·（500 mL）－1，接種量2%，于37 ℃、200r·min－1搖床培養96h。

1.3 誘變方法

1.3.1 菌懸液的制備

從平板上挑取單菌落于LB液體培養基中，37℃、200r·min－1搖床培養12h，用生理鹽水稀釋至10－5數量級，即得菌懸液。

1.3.2 紫外誘變

取5mL菌懸液于直徑為9cm 的無菌培養皿中，待用。打開紫外燈，預熱20min，待光波穩定后，將無菌培養皿放置在距紫外燈垂直距離20cm 處，開啟磁力攪拌，分別照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，于37 ℃避光培養。以未經處理的菌懸液為對照組。挑取20個單菌落進行搖瓶培養，按式（1）、（2）計算致死率與正突變率。

1.3.3 氯化鋰誘變

取0.1mL菌懸液均勻涂布于含濃度梯度為0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的氯化鋰平板培養基上，37 ℃恒溫培養20h。其中0%為對照組。挑取20個單菌落進行搖瓶培養，按式（1）、（2）計算致死率與正突變率。

1.3.4 紫外－氯化鋰復合誘變

將菌懸液先經紫外照射一段時間后，再涂布在含一定濃度的氯化鋰平板培養基上，37 ℃避光培養。挑取30個單菌落進行搖瓶培養，按式（1）、（2）計算致死率與正突變率。

1.4 篩選方法

1.4.1 初篩

將誘變后的菌液涂布于篩選培養基上培養24h，測量透明圈直徑與菌落直徑，并計算其比值（HC 值），將HC值較大的單菌落保存于斜面培養基，以備復篩。

1.4.2 復篩

將初篩獲得的菌株先進行種子液培養，再進行發酵液培養，取上清，按QB／T 1803－93方法測定α－淀粉酶酶活。

酶活定義：將1mL液體酶在pH 值為6.0、60 ℃下，1h液化1g可溶性淀粉定義為一個酶活單位（U·mL－1）。

1.5 遺傳穩定性研究

將出發菌株與復篩得到的高產菌株各連續傳代5代，每代重復3次，接入發酵培養基中，37 ℃、200r·min－1搖瓶培養96h后，離心，取上清，測定α－淀粉酶酶活，考察高產菌株傳代后產α－淀粉酶能力的穩定性。

2 結果與討論

2.1 紫外照射時間的選擇（圖1）

由圖1可看出：隨著紫外照射時間的延長，致死率逐漸升高、正突變率先升高后略微降低；當紫外照射時間為150s時，致死率達到90.4%，正突變率達到最高值25.0%；酶活提高10%以上的菌株有4株。因此，選擇最佳紫外照射時間為150s較為適宜。

2.2 氯化鋰濃度的選擇（圖2）

圖1 紫外誘變的致死率與正突變率Fig.1 Death rate and positive mutation rate of UV mutation

圖2 氯化鋰誘變的致死率與正突變率Fig.2 Death rate and positive mutation rate of LiCl mutation

由圖2可看出：隨著氯化鋰濃度的增大，致死率逐漸升高、正突變率逐漸降低；當氯化鋰濃度為0.3%時，致死率為49.2%，正突變率最大，為19.4%；酶活提高10%以上的菌株有3株。因此，選擇氯化鋰濃度為0.3%較為適宜。

2.3 紫外－氯化鋰復合誘變

在紫外照射時間為150s、氯化鋰濃度為0.3%的條件下進行紫外－氯化鋰復合誘變。

結果發現，致死率可達到96.3%，正突變率也達到了37.1%，比單一誘變效果要好。

2.4 高產菌的篩選

誘變后的單菌落在篩選平板上培養后形成淀粉圈，挑取10個單菌落進行搖瓶發酵，研究HC 值與酶活的關系，結果如表1所示。

由表1可知，HC 值的大小在一定程度上反映了菌株產α－淀粉酶的能力，HC值越大，產酶能力越強。

以枯草芽孢桿菌BL01 為出發菌株，經過多次復合誘變，初篩出HC 值較大的100 株突變株，再經復篩、發酵后測定酶活。結果發現，有58株突變菌的酶活比原始菌株提高，將其中一株酶活高且產酶穩定的菌株命名為BL01－13。該高產菌株誘變后酶活達到357.70U·mL－1，是出發菌株的2.02倍。

表1 HC值與酶活的關系Tab .1 The relationship between HC value and enzyme activity

2.5 高產菌株的遺傳穩定性（表2）

表2 高產菌株的遺傳穩定性（n＝3）Tab.2 Genetic stability of high－producing strain（n＝3）

由表2可知，高產菌株具有良好的遺傳穩定性，傳代5代后，酶活穩定在（357.73±4.06）U·mL－1范圍內。

3 結論

采用紫外－氯化鋰對產α－淀粉酶菌株枯草芽孢桿菌BL01進行復合誘變，在紫外照射時間為150s、氯化鋰濃度為0.3%的最佳誘變條件下，經過淀粉圈初篩、發酵復篩，得到一株高產菌BL01－13，酶活達到357.70U·mL－1，是出發菌株的2.02倍，該菌遺傳穩定性良好，為淀粉酶產品的開發與應用奠定了基礎。

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