金銀花耐缺氧活性部位的HPLC指紋圖譜研究

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，遼寧沈陽110122）

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，性寒味甘，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱的功效，為臨床常用中藥之一［1－3］，主要含有環(huán)烯醚萜類［4］、有機酸類［5］、黃酮類［6］等化學(xué)成分。在研究金銀花防治心血管疾病活性成分時發(fā)現(xiàn)，金銀花藥材經(jīng)水提醇沉、D101大孔吸附樹脂梯度洗脫，所得的30%乙醇－水洗脫部位能夠延長異丙腎上腺素攻擊后小鼠缺氧存活時間，提示其為金銀花提高小鼠心肌細胞耐缺氧能力的活性部位。對活性部位的進一步研究表明，其中的咖啡酰奎寧酸類成分具有較好的心肌細胞保護作用。文獻報道的金銀花指紋圖譜多集中于對藥材提取物和抗炎活性部位的研究，未見防治心血管疾病相關(guān)活性部位的HPLC 指紋圖譜研究。

鑒于此，作者采用HPLC 法，以咖啡酰奎寧酸類成分的最大吸收波長330nm 作為檢測波長，對收集的10批金銀花藥材的耐缺氧活性部位HPLC 圖譜進行分析比較，建立指紋圖譜共有模式，為金銀花防治心血管疾病相關(guān)活性部位入藥提供質(zhì)量評價依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

10批產(chǎn)地分別為山東、河南、河北的金銀花藥材（批號分別為：100902，100903，100906，100910，100912，100913，100916，100917，100918，100920）。

對照品：綠原酸（批號：110753－200413），中國藥品生物制品檢定所；反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎寧酸、3，5－二咖啡酰奎寧酸、4，5－二咖啡酰奎寧酸（經(jīng)核磁共振波譜和質(zhì)譜鑒定，采用不加校正因子的主成分自身對照法檢測，純度均大于98%），自制。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、95%乙醇（分析純），山東禹王有限公司；三氟乙酸（TFA，色譜純），北京迪馬科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；D101大孔吸附樹脂，南開大學(xué)化工廠。

Agilent 1200分析型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、DAD 檢測器、全自動進樣器），美國Agilent公司；BT124S型電子天平，北京賽多利斯有限公司；FDU－1200型冷凍干燥機，東京理化器械株式會社；ZDHW 型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：分析型Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60 mm，5μm）；檢測波長330 nm；進樣量15μL；柱溫30 ℃；流速1.0mL·min－1；梯度洗脫60min。線性梯度洗脫程序見表1。

1.3 方法

1.3.1 對照品混合溶液的配制

表1 線性梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

取綠原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎寧酸、3，5－二咖啡酰奎寧酸、4，5－二咖啡酰奎寧酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成綠原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎寧酸、3，5－二咖啡酰奎寧酸、4，5－二咖啡酰奎寧酸濃度（mmol·L－1）分別為0.240、0.268、0.071、0.089、0.108的對照品混合溶液。

1.3.2 活性部位供試品溶液的制備

取金銀花干燥藥材50g，加入400 mL 水浸泡過夜，加熱回流提取2次，每次3h，合并提取液，減壓濃縮至50mL，邊攪拌邊加入95%乙醇150mL，靜置過夜，抽濾，將濾液濃縮至無醇味，濃縮液經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱色譜分離，乙醇－水梯度洗脫，收集30%乙醇－水洗脫部位，濃縮，凍干，得到凍干粉。取凍干粉約20mg，精密稱定，溶于50%甲醇中，定容至5 mL，搖勻，即得活性部位供試品溶液。

1.3.3 測試方法

將10批產(chǎn)地不同的金銀花藥材按1.3.2方法制備活性部位供試品溶液，按1.3.1方法配制對照品混合溶液。精密量取對照品混合溶液和活性部位供試品溶液各15μL，按色譜條件測定高效液相色譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實驗

取批號為100902的藥材凍干粉，制備活性部位供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實驗

取批號為100902的藥材凍干粉，制備活性部位供試品溶液，分別在制備后0h、4h、8h、12h、16h、24h進樣，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性實驗

分別稱取批號為100902的藥材凍干粉6份，制備活性部位供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.4 檢測時間延長實驗

2倍時間色譜圖中1h 以后沒有色譜峰，說明樣品出峰完全。

2.2 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.2.1 指紋圖譜的選擇及特征峰的標(biāo)定

采用相對保留時間標(biāo)定共有指紋峰，其中色譜峰2（綠原酸）分離度良好，峰位居中，峰面積較大而且穩(wěn)定。因此，選取綠原酸為參照峰（S），將其余指紋峰的保留時間與同一圖譜中的參照峰（設(shè)定為1）進行比較，其比值為各指紋峰的相對保留時間。通過色譜圖的疊加比較，得到10 批金銀花活性部位的8 個共有峰，如圖1所示。

圖1 10批金銀花活性部位的高效液相色譜疊加圖Fig.1 HPLC Overlapping chromatograms for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae

通過與對照品對照，指認(rèn)了其中5個共有峰分別為：綠原酸（S峰）、反式咖啡酸（4號峰）、3，4－二咖啡酰奎寧酸（6號峰）、3，5－二咖啡酰奎寧酸（7號峰）、4，5－二咖啡酰奎寧酸（8號峰），如圖2所示。

利用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件（2010版）”處理，得到金銀花活性部位的指紋圖譜，如圖3所示。

2.2.2 共有峰相對保留時間及相對峰面積（表2）

2.2.3 非共有峰面積

計算了10批供試品溶液指紋圖譜中非共有峰面積及占總峰面積的百分比。結(jié)果顯示，非共有峰的峰面積占總峰面積的百分比小于10%，符合指紋圖譜有關(guān)要求。

圖2 混合對照品溶液的高效液相色譜Fig.2 HPLC Chromatograms of the mixing solution of reference substances

圖3 金銀花活性部位的指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of active fraction from Flos Lonicerae

表2 10批金銀花活性部位指紋圖譜中共有峰的相對保留時間及相對峰面積Tab.2 Relative retention time and relative areas of common peaks for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae in fingerprint

2.2.4 金銀花藥材指紋圖譜的相似度評價（表3）

由表3可知，金銀花藥材指紋圖譜的相似度均大于0.98。說明這10批金銀花藥材的化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3 討論

2.3.1 色譜柱的選擇

考察了Phenomenex Gemini C18（250mm×4.60 mm，5μm）、YMC－Pack ODS－A（250mm×4.60mm，5μm）、Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60mm，5μm）3 種不同型號色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，3種色譜柱的分離度相差不大，Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60mm，5 μm）的峰形更尖銳一些，不易拖尾。因此，選用Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60 mm，5μm）作為色譜柱。

表3 10批金銀花指紋圖譜的相似度分析Tab.3 Similarity analysis of fingerprints for 10 batches of Flos Lonicerae

2.3.2 流動相的選擇

在流動相的篩選中，嘗試等濃度洗脫的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等濃度洗脫分離時間較長，分離效果遠不及梯度洗脫，故選用梯度洗脫。

分別選用甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.5‰TFA 水溶液、乙腈－0.5‰TFA 水溶液4種體系作為流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作流動相時，各峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析。可能是由于組分中含有咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)，具有一定的酸性，需在流動相中加入少量的酸，從而改善各色譜峰之間的分離度。因此，選用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作為流動相。

2.3.3 檢測波長的選擇

研究表明，咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)具有較好的心肌細胞保護作用，因此，以咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)的最大吸收波長330nm 作為檢測波長，能使活性成分得到充分體現(xiàn)，且分離度較好。在其它波長下，咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)吸收值較小，而且受其它成分峰的干擾，分離度不好。因此，選用330nm 作為檢測波長。

3 結(jié)論

采用水提醇沉、D101大孔吸附樹脂梯度洗脫，富集金銀花中提高小鼠心肌細胞耐缺氧能力的活性部位，建立了HPLC測定金銀花耐缺氧活性部位指紋圖譜的方法，以咖啡酰奎寧酸類物質(zhì)的最大吸收波長330nm 作為檢測波長，對收集的10批金銀花藥材的耐缺氧活性部位HPLC圖譜進行分析比較，建立指紋圖譜共有模式，對其中的共有峰進行了指認(rèn)，為金銀花防治心血管疾病相關(guān)活性部位入藥提供質(zhì)量評價依據(jù)。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上冊.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006：1403－1405.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：205－206.

［3］宋衛(wèi)霞.金銀花水溶性化學(xué)成分研究［D］.咸陽：陜西中醫(yī)學(xué)院，2008.

［4］KAKUDA R，IMAI M，YAOITA Y，et al.Secoiridoid glycosides from the flower buds ofLonicerajaponica［J］.Phytochemistry，2000，55（8）：879－881.

［5］張宇平，黃可龍.高效液相色譜法同時測定金銀花中5種有機酸［J］.分析試驗室，2007，26（7）：67－70.

［6］KUMAR N，SINGH B，BHANDARI P，et al.Biflavonoids fromLonicerajaponica［J］.Phytochemistry，2005，66（23）：2740－2744.