一種手性甾體酰胺化合物的蛋白結(jié)合特征研究

（荊楚理工學(xué)院化工與藥學(xué)院，湖北荊門448000）

甾體化合物有較強(qiáng)的細(xì)胞穿透性和良好的膜接受性，在動植物生命活動中發(fā)揮著重要作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，甾體酰胺類化合物大都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抑制5α－還原酶等生物活性，且甾體結(jié)構(gòu)的微小變化可能引起此類化合物生理活性的巨大改變［2］。因此，通過對甾體母核或支鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾、研究其構(gòu)效關(guān)系，以得到具有更高生物活性或特殊生理功能的甾體化合物，已成為化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一［3］。目前，越來越多新的甾體酰胺化合物被合成出來，其中許多已被證實(shí)具有重要的藥理活性，3β－乙酰氧基－17－氮雜－D－h(huán)omo－5－雄甾烯－17－酮（3β－acetoxy－17－aza－D－h(huán)omo－5－androsten－17－one，AHAO）便是其中的一種。AHAO 是具有手性的甾體酰胺化合物，對Hela細(xì)胞有很好的抑制作用［4］，表現(xiàn)出了較為理想的抗癌活性，但其具體的藥理活性機(jī)制尚不明確。

鑒于此，作者參照文獻(xiàn)合成了化合物AHAO，并利用光譜技術(shù)研究了AHAO 與人血清白蛋白（HSA）的相互作用，獲取了AHAO 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合作用力強(qiáng)弱、結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)等方面的信息，有助于深入理解AHAO 在人體內(nèi)的運(yùn)輸過程、吸收效率、活性機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7.40，NaCl 0.15 mol·L－1）；2.0×10－4mol·L－1HSA 工作液，美國Sigma公司；2.0×10－5mol·L－1AHAO 工作液（純度＞99%），自制。

LS－55型熒光分光光度計，Perkin Elmer；YB12型超級恒溫水浴鍋，Prima；J－810 型圓二色譜儀，Jasco；AUY220型電子分析天平，Shimadzu。

1.2 AHAO 的合成路線（圖1）

圖1 AHAO 的合成路線Fig.1 The synthetic route of AHAO

1.3 方法

向10mL比色管中加入適量HSA 工作液，然后加入一定量的AHAO 工作液，以磷酸鹽緩沖溶液定容，充分混合均勻后置于超級恒溫水浴鍋中靜置30 min。設(shè)定單色器激發(fā)狹縫寬度、發(fā)射狹縫寬度分別為15nm、4nm，以290nm 的紫外光照射樣品，在300～420nm 波長范圍內(nèi)掃描并記錄HSA－AHAO 體系的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHAO 對HSA 的熒光光譜的影響

HSA 分子含有帶芳香性側(cè)鏈的不飽和氨基酸殘基，能夠吸收紫外輻射誘發(fā)價電子躍遷；若激發(fā)態(tài)價電子以非輻射的形式失活，則可發(fā)射出熒光。藥物分子在與蛋白質(zhì)作用時，可能因?yàn)榉N種原因?qū)е碌鞍踪|(zhì)內(nèi)源熒光猝滅。

不同濃度AHAO 對HSA 熒光發(fā)射光譜的影響如圖2所示。

圖2 不同濃度AHAO 對HSA熒光光譜的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AHAO on fluorescence spectra of HSA

2.2 熒光猝滅機(jī)理

導(dǎo)致熒光猝滅的原因很多，如分子碰撞、基態(tài)復(fù)合物的生成、溶解氧，就猝滅機(jī)理而言，主要有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞使得單重電子激發(fā)態(tài)電子以輻射的形式失活引起的，其熱力學(xué)性質(zhì)可以用Stern－Volmer方程描述［5］：

式中：F0為無猝滅劑時蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后蛋白質(zhì)－猝滅劑體系的熒光強(qiáng)度；KSV為動態(tài)熒光猝滅常數(shù)（L·mol－1），反映了蛋白質(zhì)與猝滅劑在彼此擴(kuò)散和相互碰撞達(dá)到動態(tài)平衡時的量效關(guān)系；［Q］為猝滅劑的平衡濃度；Kq為動態(tài)熒光猝滅的速率常數(shù)（L·mol－1·s－1），反映了體系中分子彼此擴(kuò)散和碰撞對熒光體熒光壽命衰減速率的影響；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命［6］。

為了判斷AHAO 對HSA 的熒光猝滅機(jī)理，先以動態(tài)猝滅來處理，Stern－Volmer方程擬合的曲線方程如圖3所示，根據(jù)方程計算得到的不同溫度下的動態(tài)猝滅常數(shù)KSV見表1。

圖3 Stern－Volmer曲線及方程Fig.3 Stern－Volmer curves and equations

表1 AHAO 與HSA作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)常數(shù)Tab.1 Binding constants，binding sites and thermodynamics parameters of interaction between AHAO and HSA

動態(tài)猝滅是分子間碰撞所致，溫度升高將增加分子間有效碰撞次數(shù)，加速電子轉(zhuǎn)移和能量傳遞，從而得到更高的動態(tài)猝滅常數(shù)［7］。但從表1看出，293K 時的動態(tài)猝滅常數(shù)KSV為1.433×104L·mol－1，311K時減小到1.006×104L·mol－1，這與動態(tài)猝滅的定義并不相符，表明，AHAO 對HSA 的熒光猝滅機(jī)理不是動態(tài)猝滅，而是靜態(tài)猝滅。

在靜態(tài)猝滅中，小分子與生物大分子結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)（Kb）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）可由式（2）計算：

log（F0／F－1）與log［Q］呈線性關(guān)系，斜率為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，截矩為logKb，如圖4所示。

圖4 不同溫度下的log（F0／F－1）－log［Q］曲線Fig.4 log（F0／F－1）－log［Q］Plots at different temperatures

由圖4可看出，線性回歸曲線的斜率接近1，這表明在特定條件下，HSA 分子中只有1個與AHAO 具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)；隨著溫度的升高，AHAO 與HSA 作用的結(jié)合常數(shù)Kb值減小，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n也相應(yīng)減少。

2.3 結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)

HSA－AHAO 相互作用的焓變和熵變是確定結(jié)合機(jī)理的重要參數(shù)。由于實(shí)驗(yàn)是在一個大氣壓條件下進(jìn)行，故結(jié)合作用的熱效應(yīng)和熵變可以由Van′t Hoff方程求取：以lnK對1／T作圖，擬合得到Van′t Hoff方程，如圖5所示。

ΔHθ和ΔSθ可根據(jù)方程的截矩和斜率作簡單變換得到。而吉布斯自由能ΔGθ則由吉布斯－亥姆霍茲方程（式4）求算，結(jié)果見表1。

圖5 Van′t Hoff方程Fig.5 Van′t Hoff Plot

由表1可看出，ΔHθ和ΔGθ均為負(fù)值，說明HSAAHAO 的相互作用是能夠自發(fā)進(jìn)行的放熱過程；而且與相同條件下的母體酮相比，甾體酰胺化合物AHAO與HSA 反應(yīng)的自發(fā)程度和放熱效應(yīng)都有所增強(qiáng)。

2.4 結(jié)合作用力類型

Ross等［8］指出，如果體系的ΔH和ΔS都增大，作用力一般為疏水作用力；若ΔH和ΔS都減小，作用力可能為氫鍵和范德華力；若ΔH≈0、ΔS＞0，一般是靜電作用力的特征。可見，氫鍵和范德華力對于維持HSA－AHAO 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)起到主要作用。

2.5 AHAO 對HSA二級結(jié)構(gòu)的影響

在一定波長范圍內(nèi)，如果記錄下左旋偏振光和右旋偏振光隨波長連續(xù)變化的情況，并對波長作圖，就可以得到該物質(zhì)的圓二色譜（CD 譜）［9］。HSA 和HSAAHAO 體系的圓二色譜如圖6所示。

圖6 HSA（a）和HSA－AHAO體系（b）的圓二色譜Fig.6 The CD spectra of HSA（a）and HSA－AHAO system（b）

用計算機(jī)程序計算AHAO 作用前后HSA 二級結(jié)構(gòu)中α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)相對含量的變化，結(jié)果見表2。

由表2可看出，與AHAO 作用后，HSA 分子中α－螺旋結(jié)構(gòu)減少，而β－折疊、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)均有所增加。

表2 HSA二級結(jié)構(gòu)相對含量／%Tab.2 Relative contents of different secondary structures of HSA／%

3 結(jié)論

在模擬人體血液離子強(qiáng)度和酸度條件下，甾體酰胺化合物（AHAO）與人血清白蛋白（HSA）依靠氫鍵和范德華力結(jié)合，生成了新的復(fù)合物，猝滅HSA 的內(nèi)源熒光；結(jié)合反應(yīng)的ΔHθ＝－54.64kJ·mol－1、ΔSθ＝－84.91J·mol－1·K－1，是一個自發(fā)進(jìn)行的放熱過程；與相同條件下的母體酮相比，甾體酰胺化合物AHAO 與HSA 反應(yīng)的自發(fā)程度和放熱效應(yīng)都有所增強(qiáng)。AHAO 的結(jié)合使HSA 分子中α－螺旋結(jié)構(gòu)減少，β－折疊、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加，起到調(diào)節(jié)其生理功能的作用。

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