循環冷卻水中鈣離子對生物酶緩蝕性能的影響

（中國石油大學化學工程學院，山東青島266100）

現階段循環水中常用的緩蝕劑主要有鋅鹽、聚磷酸鹽等，而生物酶緩蝕劑卻鮮有報道。生物酶作為一種環境友好物質，對循環水的緩蝕有很好的效果。可作為緩蝕劑的生物酶主要有溶菌酶和脂肪酶兩種［1］。溶菌酶又稱胞壁質酶，是一種有效的抗菌劑，可引起細菌的裂解［2－3］，通過抑制水體中的細菌數量來減緩腐蝕作用。脂肪酶可以分解脂類物質，在工業中作為催化劑得到廣泛應用［4－6］。脂肪酶可降解循環水中混入的脂類物質從而減小管道的腐蝕速率。鈣離子作為循環水中的常見離子會引起循環水管道的結垢［7－8］，對于循環水管道的使用壽命威脅很大，現行的處理方法大多是物理方法，且需要投加其它藥劑［9－10］，不但成本較高且易造成二次污染。有研究發現，鈣離子可以作為溶菌酶的輔劑提高溶菌酶的酶活性［11］，通過控制水中的鈣離子濃度提高生物酶的活性，從而提高緩蝕效果。

作者研究了循環冷卻水中鈣離子對溶菌酶和脂肪酶的酶活性、特征性能及緩蝕性能的影響，以期在降低鈣離子危害的同時提高生物酶的活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

循環冷卻水，青島某煉化企業；溶菌酶（BR，MW：145.2，酶活性＞40 000 U·mg－1），科昊生物工程有限責任公司；脂肪酶（BR，酶活性＞30 000U·g－1），上海金穗生物科技有限公司；A3碳鋼掛片（50mm×25mm×2mm）。

無水氯化鈣、殼聚糖，國藥集團化學試劑有限公司；正己烷、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司；三油酸甘油酯、鐵氰化鉀、硫酸高鐵銨，天津博迪化工股份有限公司。

78HW－1型恒溫磁力攪拌器，金壇良友實驗儀器廠；分析天平（±0.0001g），梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；UV 6000PC型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；RCC－Ⅱ型旋轉掛片腐蝕試驗儀，高郵摩天電子儀器有限公司。

1.2 循環冷卻水水質分析（表1）

表1 循環冷卻水水質分析Tab.1 Water quality analysis of circulating cooling water

1.3 方法

首先測定循環冷卻水中鈣離子濃度并采用旋轉掛片法測定溶菌酶及脂肪酶在無外加離子情況下的緩蝕率，確定其最適濃度。然后在溶菌酶及脂肪酶的最適濃度下，分別測定不同鈣離子質量濃度下兩種酶的酶活性，并測定鈣離子對溶菌酶抑菌性能及脂肪酶油脂降解能力的影響。最后測定不同鈣離子質量濃度下溶菌酶及脂肪酶的緩蝕性能。通過正交實驗確定最佳配比。

1.3.1 緩蝕性能的測定

根據GB／T 18175－2000旋轉掛片法對不同濃度的溶菌酶、脂肪酶進行緩蝕性能的測定，具體方法如下：

配制質量濃度分別為0 mg·L－1、20 mg·L－1、40mg·L－1、60mg·L－1、80mg·L－1的溶菌酶溶液及質量濃度分別為0mg·L－1、10mg·L－1、30mg·L－1、50mg·L－1、70mg·L－1、90mg·L－1的脂肪酶溶液各2L，選用A3碳鋼掛片作為腐蝕對象，在溫度40 ℃、轉速80r·min－1的條件下，在旋轉掛片腐蝕試驗儀中運轉72h。實驗結束后清洗掛片，稱量，并計算前后質量損失，做酸洗空白實驗，分別按式（1）、式（2）計算腐蝕速率X1和緩蝕率X2：

式中：m為試片質量損失，g；m0為試片酸洗空白實驗的質量損失平均值，g；s為試片表面積，cm2；ρ為試片密度，g·cm－3；t為試片的實驗時間，h；8 760為與一年相當的小時數；10為厘米與毫米的換算系數；X0為試片在未加水處理劑空白實驗中的腐蝕速率，mm·a－1。

1.3.2 溶菌酶酶活性的測定

參照GB／T 25879－2010的方法，以殼聚糖代替溶壁微球菌［12］，測定溶菌酶酶活性。具體方法如下：

配制質量濃度為20mg·L－1的溶菌酶溶液，溶液額外投加鈣離子質量濃度分別為0mg·L－1、25mg·L－1、50 mg·L－1、100 mg·L－1、200 mg·L－1的溶液，使體系中鈣離子質量濃度分別為82.57mg·L－1、107.57 mg·L－1、132.57 mg·L－1、182.57 mg·L－1、282.57mg·L－1，備用。將質量濃度為1.200g·L－1的殼聚糖乙酸鹽溶液（pH＝4.5）58mL與上述溶菌酶溶液2.0mL在55 ℃下反應60min，取出6.0 mL 至具塞試管中，加入1.0 mL 濃度為0.1 mol·L－1的堿性鐵氰化鉀溶液，搖勻，沸水中加熱5min后取出，加入濃度為0.05 mol·L－1的硫酸高鐵銨1.0 mL，以空白試劑作參比，于670nm 處測定吸光度。同時做無酶溶液的對照實驗，測定吸光度。酶活性U按式（3）計算：

式中：A為加酶溶液的吸光度；A0為無酶溶液的吸光度；m為溶液中含酶的質量，mg；100 為比例系數。

1.3.3 脂肪酶酶活性的測定

參照白光偉［13］的酶活性測定方法，測定脂肪酶活性，具體方法如下：

分別配制質量濃度為2mg·mL－1的脂肪酶溶液和離子質量濃度分別為0mg·L－1、25 mg·L－1、50 mg·L－1、100 mg·L－1、200 mg·L－1的離子溶液5份，備用。在100mL錐形瓶中加入25mL 離子溶液和25mL磷酸緩沖溶液，再加入1mL三油酸甘油酯，磁力攪拌乳化10～20 min。將乳化好的底物平均分成2份，一份加入酶溶液5 mL，另一份加入5 mL 去離子水。將兩份溶液置于35 ℃恒溫水浴中反應20 min，取出后加入95%乙醇10mL終止反應，加入5滴酚酞作指示劑，用氫氧化鈉溶液分別滴定并記錄消耗量。酶活性U′按式（4）計算：

式中：V為加酶溶液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；V0為無酶溶液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；m為溶液中含酶的質量，mg；t為反應時間，min；100為比例系數。

1.3.4 溶菌酶抑菌性能的測定

分別配制質量濃度為5mg·mL－1的溶菌酶溶液和離子質量濃度分別為0mg·L－1、25 mg·L－1、50 mg·L－1、100 mg·L－1、200 mg·L－1的離子溶液5份，備用。分別取8mL 離子溶液，加入酶溶液2 mL和新鮮循環冷卻水水樣20mL 充分混合，設置水樣空白對照后置于35 ℃恒溫水浴中反應10 min，備用。配制固體培養基，待培養基凝固后，每個培養基中加入0.2mL混合溶液，用三角刮涂勻后在30 ℃下培養24 h，每個濃度梯度做3組平行實驗，記錄菌落總數，以抑菌率表征溶菌酶的抑菌性能。抑菌率按式（5）計算：

式中：M0為無酶平板菌落數；Mi為有酶平板菌落數。

1.3.5 脂肪酶降解油脂性能的測定

分別配制質量濃度為2mg·mL－1的脂肪酶溶液和離子質量濃度分別為0mg·L－1、25 mg·L－1、50 mg·L－1、100 mg·L－1、200 mg·L－1的離子溶液5份，備用。在100mL錐形瓶中加入25mL 離子溶液和25mL磷酸緩沖溶液，再加入1mL橄欖油，磁力攪拌乳化10～20min。向乳化好的底物中加入酶溶液5 mL。將溶液置于35 ℃恒溫水浴中反應20min，取出后加入95%乙醇10mL終止反應，加入5滴酚酞作指示劑，后用氫氧化鈉溶液分別滴定，以油脂去除率表征脂肪酶降解油脂性能。油脂去除率按式（6）計算：

式中：H0為無酶油脂溶液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；Hi為有酶油脂溶液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL。

1.3.6 添加鈣離子后緩蝕性能的測定

配制溶菌酶、脂肪酶質量濃度分別為20 mg·L－1、70mg·L－1的溶液，額外投加鈣離子質量濃度分別為0mg·L－1、25mg·L－1、50mg·L－1、100mg·L－1、200mg·L－1的溶液，使體系中鈣離子質量濃度分別為82.57mg·L－1、107.57mg·L－1、132.57mg·L－1、182.57mg·L－1、282.57mg·L－1，參考1.3.1方法進行實驗，計算腐蝕速率和緩蝕率。

1.3.7 正交實驗

為了驗證鈣離子在復合型生物酶緩蝕劑中的作用效果，設計以溶菌酶質量濃度（A）、脂肪酶質量濃度（B）和鈣離子質量濃度（C）為考察因素的L9（34）正交實驗。正交實驗的因素與水平見表2。

表2 正交實驗的因素與水平／（mg·L－1）Tab.2 The factors and levels of L9（34）orthogonal design experiment／（mg·L－1）

2 結果與討論

2.1 生物酶緩蝕作用研究

2.1.1 溶菌酶緩蝕作用（圖1）

由圖1可知，隨著溶菌酶質量濃度的增加，緩蝕率先升后降，在溶菌酶質量濃度為20mg·L－1時，緩蝕率最大，為82.40%，相應的腐蝕速率為0.0194mm·a－1。這是因為，溶菌酶能抑制幾種特定細菌［14］，其殺菌作用主要是通過破壞微生物的細胞壁結構而不影響其內部結構而實現的，由于溶菌酶是一種蛋白質，酶質量濃度過高時，其它不被溶菌酶所作用的微生物可以將過剩的酶作為營養物質利用，反而削弱了溶菌酶的緩蝕作用。李鶴等［15］研究得出相似的結論。因此，確定循環冷卻水中最佳的溶菌酶質量濃度為20 mg·L－1。

圖1 不同質量濃度溶菌酶的緩蝕率及腐蝕速率Fig.1 Corrosion inhibition efficiency and corrosion rate of different mass concentration of lysozyme

2.1.2 脂肪酶緩蝕作用（圖2）

圖2 不同質量濃度脂肪酶的緩蝕率及腐蝕速率Fig.2 Corrosion inhibition efficiency and corrosion rate of different mass concentration of lipase

由圖2可知，隨著脂肪酶質量濃度的增加，緩蝕率先升后降，在脂肪酶質量濃度為70mg·L－1時，緩蝕率最大，為88.32%，相應的腐蝕速率為0.0316mm·a－1。這是因為，脂肪酶可以促進脂類物質的水解，與利用脂類的微生物形成競爭關系從而抑制微生物的生長，劉海洲等［16］研究得出相似的結論。因此，確定循環冷卻水中最佳的脂肪酶質量濃度為70mg·L－1。

2.2 鈣離子對溶菌酶性能的影響

2.2.1 溶菌酶酶活性（表3）

由表3 可知，鈣離子質量濃度在107.57～282.57mg·L－1的范圍內，對溶菌酶的酶活性均有較大的提高。當鈣離子質量濃度為182.57mg·L－1時，酶活性達到最高，為15 675U·mg－1，對于酶活性的提高效果較顯著。這與賴曉芳等［17］的研究結果相吻合。

在整個實驗離子質量濃度范圍內，鈣離子均對溶菌酶的酶活性有較大的提高，較適宜作為提高溶菌酶酶活性的助劑使用。

表3 鈣離子質量濃度對溶菌酶酶活性的影響Tab.3 Effect of Ca2＋mass concentration on the enzyme activity of lysozyme

2.2.2 溶菌酶抑菌性能（表4）由表4可知，在鈣離子質量濃度為182.57 mg·L－1時，抑菌性能最佳，與酶活性實驗結果一致。溶菌酶的特性之一就是殺菌作用，因此可應用于循環冷卻水管道防腐。由此可以推測，鈣離子對于溶菌酶的緩蝕效果將有一定的提升。

表4 鈣離子質量濃度對溶菌酶抑菌性能的影響Tab.4 Effect of Ca2＋mass concentration on the antibacterial performance of lysozyme

2.2.3 溶菌酶緩蝕性能（圖3）

圖3 不同鈣離子質量濃度下溶菌酶的緩蝕率及腐蝕速率Fig.3 Corrosion inhibition efficiency and corrosion rate of lysozyme with different mass concentration of Ca2＋

由圖3可知，在鈣離子質量濃度范圍為107.57～182.57mg·L－1時，溶菌酶的緩蝕性能非常好，緩蝕率均超過90%；在鈣離子質量濃度為182.57 mg·L－1時，緩蝕率達到最大，為99.18%，此時的腐蝕速率為0.0022mm·a－1。鈣離子的有效質量濃度范圍較大，在質量濃度范圍為107.57～182.57mg·L－1時，緩蝕率相比僅投加酶的緩蝕率（圖1，82.40%）均有較大提高。這是因為鈣離子是很好的離子穩定劑［10］，可以通過穩定酶的蛋白質結構達到提高酶活性的目的。

2.3 鈣離子對脂肪酶性能的影響

2.3.1 脂肪酶酶活性（表5）

表5 鈣離子質量濃度對脂肪酶酶活性的影響Tab.5 Effect of Ca2＋mass concentration on the enzyme activity of lipase

由表5可知，鈣離子質量濃度在107.57～282.57 mg·L－1的范圍內，對脂肪酶的酶活性均有較大的提高。當鈣離子質量濃度為182.57mg·L－1時，酶活性達到最高，為20 600U·g－1。

2.3.2 脂肪酶油脂降解能力（表6）

表6 鈣離子質量濃度對脂肪酶油脂降解能力的影響Tab.6 Effect of Ca2＋mass concentration on the lipid degradation ability of lipase

由表6可以知，當鈣離子質量濃度為182.57 mg·L－1時，脂肪酶油脂降解能力最大，與酶活性實驗結果一致。

2.3.3 脂肪酶緩蝕性能（圖4）

圖4 不同鈣離子質量濃度下脂肪酶的緩蝕率及腐蝕速率Fig.4 Corrosion inhibition efficiency and corrosion rate of lipase with different mass concentration of Ca2＋

由圖4可知，當鈣離子質量濃度為107.57mg·L－1時，相比僅投加脂肪酶的緩蝕效果（圖2，88.32%）有所下降；當鈣離子質量濃度范圍為132.57～182.57 mg·L－1時與僅投加脂肪酶的緩蝕率相差很小；在鈣離子質量濃度為182.57 mg·L－1時，緩蝕率達到最大，為92.12%，此時的腐蝕速率為0.0183mm·a－1；當鈣離子質量濃度超過200mg·L－1時，脂肪酶的緩蝕率又有所下降，相比僅投加脂肪酶的緩蝕率有所降低。這可能是由于鈣離子提高了水體的硬度，而在高硬度的水體中氯離子的腐蝕作用會被增大［18］，且鈣離子本身會引起結垢而加重腐蝕，會對脂肪酶的緩蝕作用起到一定的抵消效果。因此，在鈣離子存在的情況下脂肪酶的緩蝕作用的提高并沒有預期的效果好。

綜上，鈣離子對脂肪酶的影響較小，在選擇鈣離子濃度時應主要考慮不同濃度鈣離子對溶菌酶的影響，其濃度只要不對脂肪酶起毒害作用即可。

2.4 正交實驗結果與分析（表7）

表7 正交實驗結果與分析Tab.7 Results and analysis of orthogonal experiment

由表7可知，5＃、6＃、9＃實驗緩蝕率基本在80%以上，3＃、4＃、7＃、8＃實驗緩蝕效果很穩定，緩蝕率在90%以上，碳鋼的腐蝕速率也能控制在很低的水平。其中，4＃實驗的效果最為理想，緩蝕率達到99.59%，緩蝕效果總體良好。

由極差分析可知，最優方案為A2B3C3，即溶菌酶質量濃度為20mg·L－1、脂肪酶質量濃度為70mg·L－1、鈣離子質量濃度為157.57mg·L－1。在最優方案下進行驗證實驗，在循環冷卻水中碳鋼掛片的腐蝕速率為0.0007mm·a－1，緩蝕率達99.79%。

從正交實驗結果可以看出，在投加復合型生物酶緩蝕劑時，鈣離子起的作用要比對單一酶時起的作用更大，說明鈣離子對生物酶緩蝕劑可以起到很好的增效作用。

3 結論

（1）鈣離子對溶菌酶的緩蝕性能提高較大，當鈣離子質量濃度為182.57mg·L－1時，溶菌酶的緩蝕率達到99.18%，腐蝕速率為0.0022mm·a－1。

（2）鈣離子雖然可以提高脂肪酶的酶活性，但幾乎沒有提高脂肪酶的緩蝕性能。

（3）當溶菌酶質量濃度為20mg·L－1、脂肪酶質量濃度為70mg·L－1、鈣離子質量濃度為157.57mg·L－1時，緩蝕效果最佳，緩蝕率達99.79%，碳鋼掛片的腐蝕速率為0.0007mm·a－1。

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