黑曲霉WB－1固態發酵產單寧酶的研究

鄭重誼，資 云，張冬雪，王嬌嬌，周 輝

（1.湖南農業大學研究生院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128）

單寧酶（tannase，EC 3.1.1.20）是一種水解酶，主要由微生物產生，可使單寧分子中的酯鍵、糖苷鍵和縮酚鍵裂解，水解后生成沒食子酸，其水解速度與酶濃度成正比［1］。單寧酶在精細化工、皮革、飼料、化妝品等行業具有廣泛的應用［2］。

單寧酶除存在于富含單寧的植物中外，還廣泛存在于微生物中，能由某些真菌在沒食子酸等誘導物存在時合成，這些菌種主要分布于曲霉屬（Aspergillus）［3－4］、擬青霉屬（Paecilomyces）［5－6］、青霉屬（Penicillium）［7－8］，其中曲霉屬的黑曲霉（Aspergillusniger）是典型代表［9－10］。

五倍子是我國的一種重要的林化產品，含有豐富的可降解型單寧，主要用于提取單寧酸。作者課題組在前期實驗中從五倍子加工企業的污水排放口土壤中分離得到一株產單寧酶的黑曲霉WB－1，作者對該黑曲霉WB－1產單寧酶的發酵條件以及酶學性質進行研究，為深入了解產單寧酶的黑曲霉提供參考。

1 實驗

1.1 菌種及培養基

黑曲霉WB－1，本實驗室篩選保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA 培養基）：馬鈴薯200g，切成小塊，加1 000mL 水煮沸30min，用4層紗布濾成清液。加水補充減少的水分，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，充分混勻后于121 ℃滅菌30min。

固體發酵培養基：取5g五倍子粉和麩皮的混合物（其中五倍子粉0.5g，麩皮4.5g）、鹽溶液（組成：NH4NO35g·L－1，MgSO4·7H2O 1g·L－1，NaCl 1g·L－1）5mL充分混合均勻，自然pH 值，裝入250 mL 的三角瓶中，121 ℃滅菌20min。

1.2 單寧酶的提取及黑曲霉WB－1產酶條件研究

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將黑曲霉WB－1 在PDA 斜面上活化培養。取28 ℃培養5d的新鮮斜面若干支，每支加入5mL 無菌生理鹽水，用無菌接種環將斜面上的孢子刮下來，將孢子懸浮液移入滅菌的三角瓶中，振蕩搖勻，以上操作均在無菌臺中進行，用PDA 平板計數孢子懸浮液中的孢子數量。

1.2.2 粗酶液的提取

向固體發酵培養基中加入1mL 黑曲霉WB－1孢子懸浮液（1×1010個·mL－1），混合均勻，在28 ℃的培養箱中進行固態發酵。發酵結束后，取出裝有固態基質的三角瓶，加入50mL pH 值5.0的檸檬酸緩沖液，置于搖床上，160r·min－1振蕩提取30min，用濾紙過濾，所得濾液即為粗酶液。

1.2.3 單寧酶酶活力的測定

根據單寧酶水解沒食子酸丙酯產生沒食子酸，沒食子酸可與繞單寧在堿性條件下生成色團物質，該物質在520nm 處有最大光吸收的原理進行測定［11］。

酶活力單位定義為：在30 ℃下，每分鐘分解產生1μmol沒食子酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.4 發酵溫度對產單寧酶的影響

在發酵培養基中接入WB－1 孢子懸浮液分別于24 ℃、28℃、32℃、37℃、42℃的培養箱中培養96h，提取單寧酶并測定酶活力，比較不同發酵溫度下的酶活力大小。

1.2.5 發酵時間對產單寧酶的影響

在發酵培養基中接種WB－1孢子懸浮液，在28 ℃培養箱中進行固態發酵，分別培養24h、48h、72h、96h、120h、144h，提取單寧酶，測定單寧酶的酶活力。

1.2.6 外加碳源對產單寧酶的影響

固定發酵培養基中其它成分不變，鹽溶液中分別添加終濃度為1%的葡萄糖、蔗糖、α－乳糖、甘油、D－果糖、甘露醇作為外加碳源，接種WB－1孢子懸浮液，在28 ℃培養箱中進行固態發酵，培養96h，提取單寧酶，測定單寧酶的酶活力。

1.3 單寧酶的酶學性質研究

1.3.1 單寧酶的儲存穩定性

將提取的單寧酶粗酶液分為若干份，置于4 ℃冰箱中儲存1周、2周、3周、4周、5周后，吸取少量單寧酶粗酶液測定并計算相對酶活力，觀察單寧酶的酶活力變化。

1.3.2 反應溫度對單寧酶酶活力的影響

將單寧酶酶解反應溫度設定為20～70℃之間，比較不同反應溫度下的酶活力大小。

1.3.3 pH 值對單寧酶酶活力的影響

配制pH 值分別為3、4、5、6、7的檸檬酸緩沖液，以不同pH 值的緩沖液來配制沒食子酸丙酯溶液，進行單寧酶酶解反應，測定單寧酶活力，比較不同pH 值下的酶活力大小。

2 結果與討論

2.1 黑曲霉WB－1產酶條件研究

2.1.1 發酵溫度對產單寧酶的影響

考察不同發酵溫度下黑曲霉WB－1產單寧酶酶活力的大小，結果見圖1。

由圖1可知，在發酵溫度為28 ℃時黑曲霉WB－1產單寧酶酶活力最高，這與多數文獻中報道的黑曲霉產單寧酶發酵溫度基本一致。發酵溫度過低或過高均不利于產酶或維持酶的功能穩定性。因此，確定黑曲霉WB－1產單寧酶的最佳發酵溫度為28 ℃。

2.1.2 發酵時間對產單寧酶的影響

圖1 發酵溫度對產單寧酶的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on tannase production

考察不同發酵時間下黑曲霉WB－1產單寧酶酶活力的大小，結果見圖2。

圖2 發酵時間對產單寧酶的影響Fig.2 Effect of fermentation time on tannase production

由圖2可知，單寧酶的酶活力隨著發酵時間的延長先升高后降低，在發酵時間為96h時達到最高，為21U·g－1；超過96h后，單寧酶的酶活力下降。這是因為，隨著發酵時間的延長，單寧酶可能被菌體降解。因此，確定黑曲霉WB－1產單寧酶的最佳發酵時間為96h。

2.1.3 外加碳源對產單寧酶的影響

考察不同外加碳源下黑曲霉WB－1產單寧酶酶活力的大小，結果見圖3。

圖3 外加碳源對產單寧酶的影響Fig.3 Effect of additional carbon source on tannase production

由圖3可知，外加碳源都能提高單寧酶的酶活力，其對產酶的影響順序為：甘油＞α－乳糖＞D－果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞甘露醇。其中添加甘油的效果最好，所得單寧酶的酶活力可達19.27U·g－1。

2.2 單寧酶的酶學性質研究

2.2.1 低溫儲存穩定性（圖4）

圖4 單寧酶的儲存穩定性Fig.4 Storage stability of tannase

由圖4可知，隨著儲存時間的延長，單寧酶酶活力逐漸降低，儲存3周后酶活力保持在80%以上，儲存5周后仍有67%的酶活力。而儲存3個月后，單寧酶酶活力仍有52%，說明該單寧酶的低溫（4 ℃）儲存穩定性較好。

2.2.2 最適反應溫度（圖5）

圖5 反應溫度對單寧酶酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the activity of tannase

由圖5可知，20 ℃時單寧酶的酶活力較低，不利于單寧酶發揮催化功能，30 ℃時單寧酶的酶活力最高，可達到23U·g－1，此后隨著反應溫度的升高，單寧酶酶活力逐漸降低。說明溫度高于30℃以后，單寧酶催化反應生成沒食子酸的量減少。因此，單寧酶的最適反應溫度為30 ℃。

2.2.3 最適pH 值（圖6）

由圖6可知，單寧酶酶活力隨著pH 值的升高而升高，在pH 值為6時，酶活力達到最高，之后隨著pH值的繼續升高，單寧酶酶活力開始下降。因此，單寧酶的最適pH 值為6。

圖6 pH 值對單寧酶酶活力的影響Fig.6 Effect of pH value on the activity of tannase

3 結論

對黑曲霉WB－1固態發酵產單寧酶進行了研究。考察了發酵溫度、發酵時間、外加碳源對黑曲霉WB－1產單寧酶的影響，同時考察了單寧酶的儲存穩定性以及最適反應溫度、pH 值。結果表明，黑曲霉WB－1產單寧酶的最佳發酵溫度和發酵時間分別為28 ℃和96 h，外加碳源有利于單寧酶的產生，且以甘油為外加碳源時效果最好。所產單寧酶的最適反應溫度和pH 值分別為30 ℃和6，而且具有一定的低溫（4 ℃）儲存穩定性。

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