蕎麥七中黃酮類物質的抗氧化活性研究

同曉娟，王曉梅，2，黨 曼，張元君，劉 婷，趙立芳，2

（1.寶雞文理學院化學化工學院，陜西寶雞721013；2.寶雞文理學院陜西省植物化學重點實驗室，陜西寶雞721013）

研究表明，蓼科植物具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑制α－葡萄糖苷酶、調節(jié)血脂等生理活性［1－3］，其化學成分主要是含揮發(fā)油、黃酮類、蒽醌類、萜類及芪類等的化合物［4］。蕎麥七為蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldiiDamm.et Diels的干燥塊根，是著名的太白山“七藥”之一，是陜西民間廣為使用的一種草藥，具有涼血止血、除濕解毒的功效，民間用以治療痢疾、崩漏、腰腿痛、疔瘡、狂犬咬傷等癥［5］。

蕎麥七中化學成分主要是含黃酮類、酚酸、三萜等的化合物［6－9］。目前，關于蕎麥七化學成分的分離研究報道較多，而活性方面的研究較少。譚蘋等［10］發(fā)現蕎麥七對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度達到1∶128，與黃連相當，對福氏痢疾桿菌和宋內氏痢疾桿菌的最低抑菌濃度達到1∶64。作者在此對蕎麥七不同溶劑提取物中黃酮類物質的抗氧化活性進行研究，擬為蕎麥七中抗氧化黃酮類物質的進一步提取分離奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

蕎麥七，購于秦嶺北坡，經陜西中醫(yī)學院胡本祥教授鑒定為蕎麥七；硅膠（200～300目）、薄層層析板，青島海洋化工廠分廠。

二氯化鋯、枸櫞酸、二甲基亞砜、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、鄰二氮菲、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、雙氧水、硫酸亞鐵等均為分析純。

722N（棱光）型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；RE－52AA 型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蕎麥七不同溶劑提取物的制備

將干燥的蕎麥七粉碎后，稱取400g，分別用2倍量的氯仿、95%乙醇、60%乙醇浸泡72h，將3種浸液分別進行抽濾旋蒸，得到氯仿粗提物（A）、95%乙醇粗提物（B）、60%乙醇粗提物（C）；再依次用乙酸乙酯和正丁醇分別對A、B、C 進行少量多次萃取，得到氯仿－乙酸乙酯提取物（A－a）、氯仿－正丁醇提取物（A－b）、95%乙醇－乙酸乙酯提取物（B－a）、95%乙醇－正丁醇提取物（B－b）、60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）、60%乙醇－正丁醇提取物（C－b）。

1.2.2 黃酮類物質的鑒定

1）鹽酸－鋅粉反應

取9種提取物的少量乙醇溶液，加入少許鋅粉，振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2min內（必要時微熱）即可顯色，觀察升起的泡沫的顏色。

2）鋯鹽－枸櫞酸顯色反應

取9種提取物的少量甲醇溶液，加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，觀察溶液的顏色變化；再加入2% 枸櫞酸甲醇溶液，記錄顏色變化。

1.2.3 羥基自由基清除率的測定

由于氯仿提取物（A、A－a、A－b）較少，故未進行相關的抗氧化活性檢測。

分別配制濃度為2.0 mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b。按表1 依次加入試劑與提取物，分別配制不同實驗組，于37 ℃水浴60 min，以pH 值為7.4的PBS緩沖溶液作為參比，測定其在536nm 處的吸光度。按式（1）計算羥基自由基清除率：

式中：A1、A2、A3、A4分別為損傷度、未損傷度、樣品組、樣品本體組的吸光度。

表1 羥基自由基清除率測定實驗加樣表／mLTab.1 Sample table for hydroxyl free radical scavenging rate determination experiment／mL

1.2.4 超氧陰離子自由基抑制率的測定

1）自氧化的測定

分別移取Tris－HCl緩沖溶液3.6 mL、蒸餾水4.0mL，加入25 ℃預熱的鄰苯三酚0.2 mL，立即混勻。以Tris－HCl緩沖溶液作參比，在325nm 處測定吸光度。每30s讀一次數，以吸光度穩(wěn)定所需的時間和數值作為樣品測定時的空白組數據。

2）提取物的測定

分別配制濃度為2.0mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b。按表2 加入試劑與提取物，分別配制空白組、樣品組、樣品本體組，測定其在325nm 處的吸光度，待空白組吸光度達到穩(wěn)定時開始讀數。按式（2）計算超氧陰離子自由基抑制率：

式中：A1、A2、A3分別為空白組、樣品組、樣品本體組的吸光度。

表2 超氧陰離子自由基抑制率測定實驗加樣表／mLTab.2 Sample table for superoxide anion free radical inhibition rate determination experiment／mL

1.2.5 還原力的測定

分別取pH 值為6.6 的磷酸緩沖溶液2.5 mL、1%鐵氰化鉀2.5mL于6支試管中，加入濃度為0.02 mg·mL－1的B、B－a、B－b、C、C－a、C－b提取液1mL，于50 ℃水浴鍋中恒溫20 min后，加10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，移入離心管中，3 000r·min－1離心10 min，取上清液2.5mL，再加蒸餾水2.5mL、0.1%三氯化鐵0.5mL，混勻，室溫放置10min，測定700nm處吸光度。以pH 值為6.6的磷酸緩沖溶液為參比，平行測定3次。

1.2.6 提取物濃度對抗氧化活性的影響

分別配制濃度（mg·mL－1）為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的C－a溶液，按1.2.3 方法測定羥基自由基清除率、按1.2.4方法測定超氧陰離子自由基抑制率；分別配制濃度（mg·mL－1）為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06的C－a溶液，按1.2.5方法測定還原力，考察提取物濃度對抗氧化活性的影響。

2 結果與討論

2.1 黃酮類物質的鑒定結果（表3）

表3 鹽酸－鋅粉反應與鋯鹽－枸櫞酸顯色反應結果Tab.3 Results of hydrochloride－zinc powder reaction and zirconium salt－citrate chromogenic reaction

由表3可知：鹽酸－鋅粉反應中提取物B、B－a、B－b、C、C－a、C－b均出現紫色，而提取物A、A－a、A－b無明顯變化，表明提取物B、B－a、B－b、C、C－a、C－b中均含有黃酮類物質，其中提取物B－a、C－a紫色較深，說明乙醇－乙酸乙酯提取物中的黃酮類物質較多；鋯鹽－枸櫞酸顯色反應表明提取物A、A－a、B 和C－a中含有3－羥基黃酮類物質，提取物B－a和C 中含有5－羥基黃酮類物質。上述結果表明，蕎麥七提取物中含有3－羥基及5－羥基等其它黃酮類物質。

2.2 蕎麥七不同溶劑提取物的羥基自由基清除率（圖1）

圖1 蕎麥七不同溶劑提取物的羥基自由基清除率Fig.1 Hydroxyl free radical scavenging rate of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

由圖1可知，蕎麥七不同溶劑提取物的羥基自由基清除率都達到30%以上，其中以60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的羥基自由基清除率最高，達到67.78%。

2.3 蕎麥七不同溶劑提取物的超氧陰離子自由基抑制率

在弱堿性條件下，鄰苯三酚自氧化反應產生超氧陰離子自由基和有色中間產物，該有色中間產物在325nm 處有特征吸收，當加入超氧陰離子自由基清除劑時，溶液在325nm 處吸收減弱。實驗發(fā)現，鄰苯三酚的吸光度數據在12min后達到穩(wěn)定狀態(tài)，此時的吸光度為0.157，即空白組A1為0.157。

圖2為蕎麥七不同溶劑提取物的超氧陰離子自由基抑制率測定結果。

由圖2可以看出，蕎麥七不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基都有一定的抑制作用，且抑制率因所含黃酮類物質的種類和含量的不同而存在差異，其中60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的超氧陰離子自由基抑制率最高，為60.34%。

圖2 蕎麥七不同溶劑提取物的超氧陰離子自由基抑制率Fig.2 Superoxide anion free radical inhibition rate of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

2.4 蕎麥七不同溶劑提取物的還原力（圖3）

圖3 蕎麥七不同溶劑提取物的還原力Fig.3 Reducing capacity of root of Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels extracted by different solvents

由圖3可以看出，蕎麥七不同溶劑提取物均有一定的還原力且差異較小，提取物B－a、B－b、C 和C－a的還原力相近，都在0.5左右，60%乙醇－乙酸乙酯提取物（C－a）的還原力最高，達到0.542。

2.5 提取物濃度對抗氧化活性的影響

以提取物C－a為例，考察提取物濃度對抗氧化活性的影響，測定了不同濃度提取物C－a的羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基抑制率和還原力，結果見圖4。

由圖4可看出，隨著提取物C－a濃度的增大，羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基抑制率、還原力都顯著升高。表明，提取物C－a中黃酮類物質的抗氧化活性與其濃度存在一定的線性關系。

3 結論

對蕎麥七不同溶劑提取物中的黃酮類物質通過化學模擬體系進行了抗氧化活性測試，發(fā)現其對羥基自由基具有清除作用，對超氧陰離子自由基具有抑制作用，并且具有一定的還原力。說明蕎麥七中的黃酮類物質具有抗氧化活性，但黃酮類物質的種類和含量不同，其抗氧化活性也存在差異，其中60%乙醇－乙酸乙酯提取物中的黃酮類物質的抗氧化活性最高，且隨濃度的增大而升高。該研究為蕎麥七黃酮類抗氧化活性物質的進一步分離奠定了基礎。

圖4 提取物C－a濃度對抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of concentration of extract C－a on antioxidation activity

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