山銀花綠原酸提取方法的比較

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中草藥與天然產(chǎn)物研究室，湖南長沙410128）

山銀花為常用中藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效［1］，同時山銀花還是重要的化工原料和優(yōu)良飲品原料［2］。山銀花分布廣，在我國西南、中南地區(qū)有大量栽培［3－5］。湖南邵陽、婁底、懷化等地區(qū)的山銀花藥材商品名為“湘銀花”，其產(chǎn)量占全國山銀花總產(chǎn)量的40%以上。

作者在此分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中的綠原酸，并通過高效液相色譜測定綠原酸含量，比較各種方法的提取效果，以期為植物有效成分的提取提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

山銀花，湖南省隆回縣小沙江鎮(zhèn)金銀花基地；纖維素酶；綠原酸。

無水乙醇、甲醇、磷酸等均為分析純；乙腈為色譜純；蒸餾水。

KQ3200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；THZ－92B 型臺式恒溫振蕩器，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DK－S24型恒溫水箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；中草藥粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義英峪予華儀器廠；R－1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；1200型高分離度快速液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山銀花中綠原酸的提取

1）水提法

將山銀花莖于60 ℃恒溫干燥后用中草藥粉碎機粉碎。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，分別用10 倍量、10 倍量、8 倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽濾，取濾液于60℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

2）醇提法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于250mL 圓底燒瓶中，加75%乙醇，分別用10 倍量的75%乙醇于80 ℃下加熱回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽濾，取濾液于60 ℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

3）酶解法

精確稱取0.5g纖維素酶（2 000IU·g－1）定容于100mL容量瓶中配制成0.5%纖維素酶液。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100 mL 錐形瓶中，加入10倍量0.5%纖維素酶液處理15 min，迅速高溫滅活，將處理液分別用10倍量60%乙醇和10倍量蒸餾水于80℃加熱回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽濾，取濾液于60 ℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

4）超聲波法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，加入12 倍量蒸餾水，在超聲波清洗器中處理0.5h，再分別用10倍量、10倍量、8倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽濾，取濾液于60℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

5）微波法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，先用少量乙醇潤濕，再加入1.25倍量的75%乙醇，用微波快速汽化處理70s后，用25倍量的90 ℃水洗滌10min，再用水提法提取得綠原酸粗提物。

1.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜（圖1）

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜Fig.1 The HPLC of chlorogenic acid standard

HPLC 條件：流動相為乙腈－0.4%磷酸（23∶77，體積比），流速為1mL·min－1，柱溫30 ℃，檢測波長324nm，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1 000。

1.2.3 綠原酸提取率的測定

將綠原酸粗提物置于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻；再稀釋50 倍，用50%甲醇定容，搖勻；0.45μm 濾膜過濾，備用。用流動相將柱子洗脫干凈后，進樣5μL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品進行校正。取待測樣品5 μL進樣，測得各樣品的峰面積。根據(jù)標(biāo)樣濃度以及樣品峰和標(biāo)樣峰的面積比可求得各提取液中綠原酸含量，按下式計算綠原酸提取率：

2 結(jié)果與討論

2.1 提取效果比較

采用5種方法提取山銀花中的綠原酸，比較各方法所得綠原酸含量和提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。具體比較如下：

（1）水提法提取率為4.51%，醇提法提取率為3.14%，水提法提取率明顯高于醇提法，且相對于醇提法，水提法藥品消耗量少、步驟簡單。這是因為，綠原酸的水溶性好，易溶于熱水，在25 ℃水中的溶解度約為4%，故水提法提取率高于醇提法。

圖2 不同方法所得綠原酸含量（a）和提取率（b）比較Fig.2 Comparison of content（a）and extraction rate（b）of chlorogenic acid by different methods

（2）醇提法和酶解法均是在80℃下用乙醇加熱回流提取2次，醇提法提取率為3.14%，酶解法提取率為4.14%，酶解法提取率明顯高于醇提法。這是因為，山銀花用纖維素酶處理后，細胞壁中結(jié)構(gòu)致密的纖維素水解成水溶性糖類物質(zhì)，有利于胞內(nèi)物質(zhì)（綠原酸）溶出，綠原酸提取率相應(yīng)提高。如能控制好酶處理溫度及作用時間則能大幅提高山銀花中綠原酸提取率。酶解法操作簡便、提取物純度高、無有機溶劑殘留，但生產(chǎn)成本較高，其可行性有待進一步研究。

（3）超聲波法提取率為4.62%。超聲波能擊碎細胞壁，使細胞內(nèi)組分滲透到溶液中，從而達到分離的目的。該法提取率高、綜合成本低、污染小、易過濾，無醇提法中因溶劑使用帶來的不利。但山銀花經(jīng)超聲波處理后呈糊狀黏稠，不利于后續(xù)操作，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，其可行性有待進一步研究。

（4）微波法提取率為4.69%。與超聲波法相比，微波法不僅提取率高、提取時間短，且重復(fù)性好，可用于植物有效成分的快速分析，但操作步驟繁瑣，不適宜大量樣品的處理。

2.2 方差分析（表1，表2）

表1 5種方法提取率的描述性指標(biāo)Tab.1 The descriptive index of extraction rate by five methods

表2 5種方法提取率的兩兩比較（LSD法）Tab.2 The binary comparison of extraction rate by five methods（LSD method）

由表2可知，以LSD 法作均數(shù)進行兩兩比較的結(jié)果為：水提法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異（具有統(tǒng)計學(xué)意義）；醇提法與水提法、酶解法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異；酶解法與水提法、醇提法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異；超聲波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異；微波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異。

2.3 討論

（1）酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率，其中提取率最高的是微波法，酶解法和超聲波法也能得到較高的提取率，但只適合提取少量樣品，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，其可行性有待進一步研究。

（2）綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫加熱易氧化分解，因此，高溫及長時間加熱不利于山銀花中綠原酸的提取。在堿性條件下，綠原酸可發(fā)生水解，在提取純化時也應(yīng)予以注意。綠原酸分子中含有5個羥基和1個羧基，在水中溶解度達4%，因此，從經(jīng)濟、適用和安全角度出發(fā)，大量提取山銀花中綠原酸時，多以水為溶劑。

3 結(jié)論

分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中綠原酸，提取率大小依次為：微波法（4.69%）＞超聲波法（4.62%）＞水提法（4.51%）＞酶解法（4.14%）＞醇提法（3.14%）。可以看出：水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提取山銀花中綠原酸，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。

［1］張英華，陳新，張國飛，等.芪冬頤心口服液中綠原酸的含量測定［J］.長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1998，14（3）：52.

［2］張華年，楊少芳，陳繼業(yè)，等.HPLC 同時測定雙黃連注射液中綠原酸和黃芩苷2種指標(biāo)成分含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1999，16（6）：47－49.

［3］周日寶，賀又舜，羅躍龍.湖南省大宗道地藥材的資源概況［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5（2）：71－74.

［4］茍占平，萬德光.四川忍冬屬藥用植物資源調(diào)查［J］.華西藥學(xué)雜志，2005，20（6）：480－482.

［5］茍占平，萬德光.重慶忍冬屬藥用植物資源研究［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，27（4）：10－11.