響應面法優化竹葉總黃酮的提取工藝

陳 宇，陳基棚，董映雪

（莆田學院 環境與生物工程學院，福建 莆田 351100）

竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，研究表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和其他生物活性成分，如酚酸、活性多糖、香豆素類內酯、蒽醌類化合物、特種氨基酸等[1].生物類黃酮化合物具有抗衰老、預防心血管疾病和清除自由基等生理功能[2].目前，對竹葉黃酮類物質的研究已成為一個熱點，鄔建敏等采用高效液相色譜法測定10種竹類的葉、枝中黃酮類化合物的含量，得出竹葉中的黃酮含量要高于竹枝中的黃酮含量[3].宋倩等[4]利用響應面法對核桃殼總黃酮的提取工藝進行優化，得到核桃殼總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度59%，提取溫度為78℃，液固比為33∶1，核桃殼總黃酮含量為3.61mg?g-1.晏麗等[5]采用微波輔助提取，正交法優化提取工藝，研究石榴葉總黃酮的提取工藝，結果表明:黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度80%、提取功率200W、提取時間2min、提取次數3次.

目前，國內對黃酮類化合物的提取有水提法、醇提法，而且以醇提法研究居多，采用響應面法優化竹葉黃酮的提取工藝的研究鮮有報道，為此，本研究以莆田學院校園內的竹子葉片為材料，采用響應面法優化黃酮提取工藝，為竹子的綜合開發利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

竹葉（佛肚竹）采自莆田學院芳名湖畔，經烘箱60℃烘干，再用研缽研碎，過60目篩備用.

1.1.2 試劑

蘆丁標準品（99%，鄭州荔諾生物科技有限公司），氫氧化鈉、三氯化鋁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醇、石油醚等均為分析純試劑.

1.1.3 主要儀器

BS224S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；722型分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；RE52CS-2旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；DGH-9246電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 竹葉黃酮的提取工藝

稱取一定量干燥的竹葉顆粒，加入一定量體積和一定量濃度的溶劑，在一定溫度下加熱回流提取一定的時間，過濾，濾渣用少量不同濃度溶劑洗滌合并濾液，再用旋轉蒸發儀除去多余的溶劑，將所得的濃縮液用石油醚萃取多次后，取下層溶液，定容至50mL，充分搖勻備用[6].

1.2.2 黃酮含量的測定

標準曲線的繪制參照陳宇等的方法[6]，得到蘆丁溶液濃度C(mg·mL-1)與吸光度A的回歸方程為：A=10.114 3C-0.0096，相關系數R2為0.996.

1.2.3 響應面優化試驗設計

在陳宇等[6]單因素試驗的基礎之上，選擇乙醇濃度（A）、料液比(B)、水浴溫度(C)和反應時間(D)為四個因素對竹葉黃酮類物質提取率的影響，取四個因素中較優的三個水平來作對比選用，Design-Expert V8.0.6試驗設計，以竹葉的總黃酮得率為響應值，進行響應面分析試驗(Box-Behnken)，試驗的因素水平見表1.

表1 竹葉提取工藝響應面試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

以A、B、C、D為變量，以竹葉總黃酮提取率為響應值（Y），進行了響應面分析試驗，做試驗方案及結果見表2.表中1~24號是析因試驗，25~29號是中心試驗.29個試驗點是析因點和零點，其中析因點是自變量取值在A、B、C、D所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計實驗誤差[7].

將實驗值Y對方程的預測值Y0一一對應，擬合后得竹葉總黃酮得率的實驗值與預測值對應關系的線性方程：Y=0.957X+0.034，R2=0.961.方程的斜率為0.957，方程的相關系數R2為0.961.這顯示了方程的預測值與實驗值符合性的比較好.

利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗結果進行多元回歸擬合分析處理，得到回歸方程為：

2.2 方差分析

表3可知，每一項的顯著性用F值和P值顯示.F值越大和P值越小，表明了該項在方程中顯著性很明顯.由此直接得出，最顯著的項是乙醇濃度（A）項和模型的項，以及乙醇濃度的二次項(A2)、料液比的二次項（B2）、水浴溫度的二次項（C2）、反應時間的二次項（D2）、乙醇濃度和水浴溫度的交互項（AC）、乙醇濃度和反應時間的交互項（AD）、料液比和反應時間的交互項（BD），它們的P值均小于0.0001.其次是料液比（B）項p=0.0072.而反應時間的一次項(D)p=0.0176，稍微大于0.01和小于0.05，在此期間也表現出顯著性，因此它對提取黃酮有很大的影響.

表2 提取工藝設計方案響應值及對應的預測值

表3 竹葉中總黃酮提取回歸模型的方差分析

模型的顯著性水平是小于0.0001，此時線性回歸方程模型是極顯著的，說明了該方程與實際情況擬合的比較好，更好的反映了竹葉中總黃酮的得率與乙醇濃度、料液比、水浴溫度、提取反應時間的關系.

結果表明，利用水浴從竹葉中提取總黃酮，乙醇濃度的變化對黃酮提取量影響最大(p<0.0001)，料液比的影響也非常顯著(p=0.0072)，反應時間的影響也相當顯著p=0.0176.

2.3 響應面各因素的交互作用分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗結果進行多元回歸擬合分析處理，得到兩個自變量的三維效應曲面圖，通過響應面三維圖，從而直觀地反映了各各因素間的交互作用對響應值的影響，通過比較1各圖可得：乙醇濃度對黃酮的提取的影響比較顯著，表現為曲線較陡，提取的乙醇濃度最佳值為55%附近，提取的料液比次之，也顯著，其最佳值是1g:35.8mL附近，其后是提取反應時間，最佳值是3.48h，而水浴溫度比對黃酮的提取的影響不大，表現為曲線較為平滑的，隨著其含量的增加或減少，它的響應值變化較小，其最佳值分別為在水浴溫度72℃左右.

圖1是由多元回歸方程式（1）的擬合方程所做的響應曲面圖.由此可對任何兩因素相互影響對竹葉總黃酮的提取進行分析，以確定以總黃酮的得率為響應目標的最好的因素水平范圍.

從圖1-A可知，因素C水浴溫度和因素D反應時間處于最佳值(分別是70℃，3h)條件下，因素A乙醇濃度和因素B料液比對提取黃酮得率的相互影響.黃酮得率響應值隨著因素A和B的水平都從低到高變化，然后再降低，中間存在著一個高響應值的范圍，形成了典型的二次曲面.所以，當在乙醇濃度處于48.75%-57.50%左右范圍，料液比控制在1:30g.mL-1左右，可以有較高的得率.

從圖1-B顯示了因素B料液比和因素D反應時間在最佳值（分別是1:30g.mL-1，3h）時，因素 A乙醇濃度和因素C水浴溫度對提取黃酮得率的交互影響.從三維曲面圖中可知，有一個比較平緩的二次曲面，在最佳的因素B和D，因素A和B對黃酮得率影響比較平緩.

從圖1-C、圖1-D、圖1-E、圖 1-F可得，一定因素處于最佳值時，其他因素都對提取黃酮得率都有交互影響.雖然二次曲面相對于圖1-A不是很明顯、平緩些，但在控制每個因素時都在較高水平中.

2.4 最佳條件的預測與驗證試驗

為了更好的確定最佳值，從模型取值范圍內選擇出最低點的出發點，按模型使用快速上升法進行了優化[8]，可得知乙醇濃度55%，液料比1g:35.8mL，水浴溫度是72℃，提取反應時間是3.48h.此時竹葉總黃酮的得率為1.038%.為了更好驗正Box-Behnken試驗設計所得出結果的合理性，采用了上述優化提取最佳條件下進行對竹葉總黃酮的水浴提取.5次平行試驗平均總黃酮得率為0.996%，理論值為1.038%.總黃酮的實際值／模型最佳值=0.98，這說明此最佳模型合理有效.對Box-Behnken試驗設計得出的最佳的結果具有較好的可靠性.

3 結論

本實驗是水浴蒸餾法，以竹葉為原料，以蘆丁為標準，Box-Behnken設計建立了4因素3水平的響應面分析，建立乙醇濃度、料液比、水浴溫度、提取的反應時間與響應值總黃酮得率的交互影響的數學模型和回歸方程，繪制了2個自變量的三維響應曲面圖，通過目標函數的二次回歸方程預測最佳工藝條件，找到整個區域上各因素的最佳組合和響應值的最佳值，從而得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度55%，料液比1g:35.8mL，水浴溫度72℃，反應時間3.48h，此條件下的黃酮得率為0.996%.總黃酮的得率的實驗值和預測值相接近，水浴蒸餾法Box-Behnken設計對提取條件進行優化，回歸方程的決定系數是0.9643，方程較為顯著，擬合較好，精密度好，預測性較好，合理可行.

〔1〕陸志科,謝碧霞.不同種竹葉的化學成分及其提取物抗菌活性的研究 [J]西北林學院學報,2005,20(1):49-52.

〔2〕張英.竹葉黃酮的生理與藥理活性[J].世界竹藤通訊,2004,2(2):1-11.

〔3〕鄔建敏,賈之慎,唐云湖.竹類黃酮化合物總量及蘆丁含量的測定[J].浙江農業大學學報,1998,24(4):425-428.

〔4〕宋倩,趙聲蘭,劉彬球,等.響應面法優化核桃殼總黃酮提取工藝的研究[J].食品工業科技,2013,34(11):214-217.

〔5〕晏麗,黃美娥,付招.微波正交法提取石榴葉總黃酮工藝[J].江蘇農業科學,2010(6):403-404.

〔6〕陳宇,鄧金木,林麗麗,等.竹葉總黃酮提取工藝研究[J].莆田學院學報,2012,19(2):38-41.

〔7〕李珍,哈益明,李安,等.響應面優化蘋果皮渣多酚超聲提取工藝研究 [J].中國農業科學,2013,46(21):4569-4577.

〔8〕王衛東,李超,崔恒薇,等.響應面法優化微波輔助提取蘆筍黃酮的研究[J].中國食品添加劑,2010(6):72-76.