重樓地上部分薯蕷皂苷含量的HPLC分析

重樓地上部分薯蕷皂苷含量的HPLC分析

宋發軍, 劉佳, 張鵬*, 余曉東,吳瑞云

(中南民族大學 生命科學學院，生物技術國家民委重點實驗室，武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

摘要為評價重樓地上部分薯蕷皂苷的藥用價值，用超聲法提取了地上部分的甾體皂苷，采用Venusil XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈和水梯度洗脫為流動相，在210 nm波長處檢測了薯蕷皂苷含量.結果建立了有效的分離薯蕷皂苷色譜條件，果皮、外種皮、葉片、地上莖、種子提取物中僅葉片、果皮中含有薯蕷皂苷，分別約為8.610 mg/g 和4.679 mg/g. 說明重樓地上部分的果皮和葉片具有藥用開發價值.

關鍵詞重樓；薯蕷皂苷；HPLC

收稿日期2014-07-11 *通迅作者張鵬(1977-)，男，副教授，研究方向：藥用植物及其內生菌，E-mail:zhangpenghust@126.com

作者簡介宋發軍(1967-)，男，教授，研究方向：應用生物化學，E-mail: songfajun@mail.scuec.edu.cn

基金項目國家自然科學基金資助項目(31370118)；中南民族大學大學生創新創業資助項目(GXX14205)

中圖分類號R284;R917文獻標識碼A

HPLC Analysis of the Content of Dioscin

in the Aerial Parts ofParispolyphylla

SongFajun,LiuJia,ZhangPeng,YuXiaodong,WuRuiyun

(Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China，

Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission，College of Life Sciences，

South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074)

AbstractTo evaluate the medicinal value of the aerial parts of Paris polyphylla, dioscin was extracted from the aerial parts with ultrasonic method and its content was detected with a Venusil XBP C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm,5 μm), at the wavelength of 210 nm, using acetonitrile and water as mobile phase for gradient elution. The results indicated that an effective HPLC condition was obtained to extract the dioscin. And the dioscin was only found in the leaves and pericarps among the extracts from pericarps, testa, stems, leaves and seeds, detected as 8.610 mg/g and 4.679 mg/g respectively. It was therefore the pericarps and leaves in the aerial parts of P.polyphylla that possessed medicinal development value.

KeywordsParis polyphylla; dioscin; HPLC

重樓為百合科，多年生草本植物，主要分布在云南、四川、廣西等地. 根莖為主要藥用部位[1]，具有抗腫瘤、止血、免疫調節、鎮靜鎮痛、調節心腦血管等藥理作用[2-4]. 重樓化學成分復雜，主要有效成分和生理活性物質是甾體皂苷[5-7]. 甾體皂苷多為薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元為母核的皂苷.

重樓作為多年生草本，生活環境苛刻，野生資源緊缺，地下根莖需3～5年才能入藥，地上部分多被遺棄，造成資源浪費. 近年隨著市場對重樓需求量的不斷增加，重樓市場資源緊缺，開發重樓地上部分可充分利用重樓資源，緩解重樓資源的匱乏，具有重要的意義.

本文提取了重樓地上部分(莖、葉、果皮、種皮、種子)的薯蕷皂苷，采用HPLC法檢測其含量并比較了含量的差異，以評價不同地上部位的開發價值，為充分開發重樓地上部分，提高重樓資源利用率提供參考.

1儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1200, 美國)，超聲波清洗儀(KQ-500E型, 昆山市超聲儀器有限公司)，分析天平(METTLER TOLEDO, 瑞士奧然科技有限公司).

重樓地上部分(莖、葉、果皮、外種皮、種子)采集于湖北恩施土家族苗族自治州巴東七葉芬芳中藥材科技開發有限公司的種植基地(由中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定)，薯蕷皂苷標準品(CAS：19057-60-4, 上海源葉生物科技有限公司, 純度≥98%)，甲醇、乙腈(色譜級, 國藥集團化學試劑有限公司).

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0～10 min, 20%～34%A; 10～20 min, 34%～38%A; 20～25 min, 38%～40%A; 25～40 min, 40%～60%A; 40～55 min, 60%～80%A)，柱溫20℃，流速0.8 mL/min，波長210 nm，進樣量20 μL.在該色譜條件下，薯蕷皂苷目標峰的保留時間為41.38 min.

2.2標準品溶液的制備

分別量取薯蕷皂苷粉末適量配成0.80 mg/mL的薯蕷皂苷標準品儲備溶液. 將儲備溶液配成濃度為0.72 , 0.60 , 0.40 , 0.20 , 0.08 mg/mL標準品溶液.

2.3供試品溶液的制備

準確稱取烘干樣品粉末0.5 g，50 mL甲醇超聲30 min，過濾并收集濾液，蒸干得甲醇粗提物.粗提物用水溶解后，正丁醇萃取得到正丁醇相，經減壓濃縮后，用甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用.

2.4線性關系考察

精密吸取以上對照品溶液由低濃度至高濃度各20 μL依次注入高效液相色譜儀. 以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線(見圖1).線性回歸方程為Y=2114.0740X-7.3582，r=0.9999. 結果表明：在1.6～16 μg，進樣量與峰面積值間呈良好線性關系.

ρ/(mg·mL -1) 圖1　不同濃度的薯蕷皂苷標準品HPLC譜圖(a)和標準曲線(b) Fig.1　HPLC chromatograms(a) and standard curve(b) of authentic dioscin with different concentrations

2.5精密度、穩定性分析

取重樓標準品溶液，連續進樣5次，進樣量為10 μL，記錄峰面積，計算薯蕷皂苷峰面積，RSD=1.42 %，說明儀器精密度良好.

取重樓標準品溶液，分別在0, 6, 12, 24, 36, 48 h進樣測定，進樣量為10 μL，記錄峰面積，計算薯蕷皂苷的峰面積的RSD=1.74%，說明重樓標準品溶液在48 h穩定.

2.6重復性和加樣回收率試驗

取重樓果皮烘干粉末5份，每份約0.5 g，依據上述提取和測定，結果薯蕷皂苷的 RSD=1.861%，說明方法重復性良好. 取薯蕷皂苷含量為0.4679%的重樓果皮烘干粉末5份，每份約0.5 g，分別精密加入重樓標準品儲備溶液1 mL，按供試品溶液處理方法制備供試液，測定薯蕷皂苷的含量，薯蕷皂苷加樣回收率為96.01%，RSD=2.174%，說明方法準確、可靠，符合分析要求.

2.7樣品含量測定

分別制備重樓地上莖、果皮、外種皮、葉片及種子的樣品溶液，每份樣品的制備各進行3次重復，并按照本文建立的色譜條件分別進行測定(見圖2)，測得僅有果皮和葉片中含有薯蕷皂苷，含量分別為(4.679 ± 0.102)mg/g和(8.610 ± 0.281)mg/g.

1-薯蕷皂苷 圖2　重樓地上地上莖(a)、種子(b)、果皮(c)、外種皮(d)、葉片(e)高效液相色譜圖 Fig 2　HPLC chromatograms of authentic dioscin and the ground stems(a), pericarps (b), seeds (c), leaves (d), testa (e) of Paris polyphylla

3討論

薯蕷皂苷具有重要的藥用價值，特別是在抗腫瘤、免疫調節、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用頗受重視[8]. HPLC法是重樓皂苷檢測的常用方法，其中Zhang等[9]利用HPLC定性并定量測定了重樓中甾體皂苷的含量，Man等[10,11]利用HPLC-ELSD和HPLC-MS/MS分析了多種甾體皂苷的含量.本文通過考察不同的色譜條件對分離效果的影響，建立了改良的有效分離薯蕷皂苷的HPLC檢測方法，為開發重樓地上部分的藥用價值提供了參考.

重樓中薯蕷皂苷含量的現有研究多集中在地下根莖，地上部分的研究甚少.本文通過選取合適的提取方法，考察其重復性和樣品回收率，建立了簡便省時、穩定可靠的提取方法， HPLC檢測結果表明：僅葉片和果皮中含有薯蕷皂苷，含量分別約為8.610 mg/g 和4.679 mg/g，且葉片中含量大于果皮，具有潛在藥用開發價值.本研究為深入評價重樓地上部分的藥用價值提供了參考.

參考文獻

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