實時定量PCR鑒定轉基因作物純合體

實時定量PCR鑒定轉基因作物純合體

張麗，劉麗麗，梁曉聲，王海英

(中南民族大學 生命科學學院 武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

摘要以水稻內標準基因磷脂酶D基因(phospholipase D， PLD)和轉基因水稻TT51-1特異性旁側序列為檢測靶標，對單株轉基因水稻的種子播種后長出的單株進行了熒光定量PCR，以其內標準基因和旁側序列Ct值的差值判斷了植株的純合體，并用標準曲線計算了轉基因含量，證實了此法的可靠性，說明此法用于鑒定植株的純合體簡便準確.

關鍵詞轉基因作物；純合體；內標準基因；旁側序列；實時熒光定量PCR

收稿日期2014-06-11

作者簡介張麗(1985-),女,博士,講師,研究方向:植物分子生物學, Email: zhangli0624@gmail.com

基金項目國家自然科學基金資助項目(31401607，31300829)，中南民族大學中央高校基本科研業務費專項資助項目(CZQ13009)

中圖分類號Q788文獻標識碼A

Identification of the Homozygosis of Genetically Modified

Crop by Real-time Quantitative PCR

ZhangLi,LiuLili,LiangXiaosheng,WangHaiying

(Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China,

College of Life Sciences, South Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractRice endogenous reference gene phospholipase D gene (PLD) and genetically modified (GM) rice TT51-1 event-specific flanking sequence were used as PCR detection targets. And the homozygosis of GM rice TT51-1 plants originated from single plant seeds were analyzed through real-time PCR assays, which analyzed the △Ct value of the endogenous reference gene and the flanking sequences. The reliability of this method was verified by calculation of GM copy number ratio based on the standard curves. It was concluded that the method was simple and accurate to identify the homozygosis of GM crops.

Keywordsgenetically modified crops; homozygosis; endogenous reference gene; flanking sequences; real-time quantitative PCR

純合的轉基因植株不僅可用于育種研究，還可用于制備轉基因檢測的標準物質[1].在研制轉基因作物標準物質時，需要大量的候選物，并對其純合度進行鑒定，候選物的純合度直接影響了標準物質的量值[2]，故建立一種簡單、有效的純度鑒定方法具有重要意義.

目前主要用定性PCR和熒光定量PCR對轉基因作物的純合體進行鑒定.定性PCR法是利用4個引物的多重PCR 反應，根據PCR擴增條帶數和條帶的大小來鑒定轉基因植株的純合體，它要求在遺傳轉化過程中未發生重組，并且需要有詳細的外源基因插入位點信息[3].熒光定量PCR是將盲樣的Ct值代入所繪制的標準曲線，計算外源基因和內標準基因的拷貝數，轉基因含量GM(%)=外源基因拷貝數/內標準基因拷貝數×100%.轉基因含量約100%為純合，約50%的為雜合，約0%的為非轉基因.以上方法中，定量PCR法要求其標準曲線的繪制較為繁瑣，且一般標準樣品與分析樣品在同一PCR板上，也限制了每次分析的樣品量[4].

本文以轉基因水稻為研究對象，以單株轉基因水稻的種子為起始材料，將種子播種后長出的單株為轉基因標準物質研制的候選物，并對其純合度進行研究和鑒定，建立了一種快速的轉基因純合度分析方法.

1材料與方法

1.1儀器和材料

Bio-Rad CFX96 Real-time PCR Detection System (Hercules, USA)，轉基因水稻TT51-1種子和純陽性轉基因水稻TT51-1 DNA標準品由華中農業大學提供，DNA小量提取試劑盒DNA easy Plant Mini Kit(QIANGEN公司)，熒光定量PCR試劑盒TaqMan? Universal PCR Master Mix(ABI公司)，PCR引物和探針(上海生工生物工程技術服務有限公司)，Taqman探針5’熒光基團用FAM標記，3’熒光淬滅基團用TAMRA標記，引物探針序列如表1所示[5].

表1　檢測所用的引物序列及擴增片段長度

1.2轉基因水稻TT51-1植株的繁殖

將來自同一穗的轉基因水稻種子于約37℃下水泡萌發，轉移到溫室中種植，待其長出一定葉片后，收取部分子葉用于基因組DNA提取和PCR擴增鑒定.

1.3基因組DNA 的提取

參考操作說明書提取植物基因組DNA.采用Picogreen法測定DNA濃度，用紫外分光光度法測定OD260/280檢測質量和純度.

1.4熒光定量PCR反應體系和反應條件

熒光定量PCR反應熒光信號通過CFX manager software program進行信號收集和分析.水稻內標準基因PLD和TT51-1轉化體事件特異性旁側序列的反應體系為：1×Taq Man Universal PCR Master Mix，400 nM正向引物，400 nM反向引物，200 nM探針，1.5 μL模板DNA，加ddH2O至20 μL.反應條件為：50℃ UNG酶處理2 min，94℃預變性10 min，再94℃ 15 s，60℃ 1 min，45個循環.

2結果與分析

2.1樣品的定量PCR擴增和純合體鑒定

本文隨機選取16個單株，對這16個單株提取基因組DNA后進行熒光定量PCR，水稻內標準基因PLD和TT51-1轉化體事件特異性旁側序列的Ct值結果如表2所示. 由于每個模板的Ct值與其拷貝數的對數成線性關系，起始模板拷貝數越多，Ct值越小，則外源基因與內標準基因的Ct值之差越小.根據遺傳學定律，經過繁殖后的單株中只存在非轉基因、轉基因雜合、轉基因純合3種情況.通過分析表2中的外源基因和內標準基因的Ct差值，可將16棵植株分為3類(圖1)：第一類外源基因和內標準基因的Ct值之差較大，這是由于該基因組DNA中無外源基因擴增，Ct值顯示無擴增或超過38個循環的非特異擴增，10、12、16號植株為非轉基因水稻；第二類和第三類的轉基因水稻的外源基因和內標準基因的Ct值之差分別約為1.8和0.8，第二類的轉基因水稻的起始模板拷貝數較第三類少，故第二類轉基因水稻為雜合，6、8、13、15號植株為雜合轉基因水稻；1、2、3、4、5、7、9、11、14號植株為純合轉基因水稻.此外，純合轉基因植物與雜合轉基因植物相比，在熒光定量PCR反應中也表現出兩者△Ct值約為1，與理論上兩者轉基因含量為2倍之差相符.

表2待測樣品的擴增結果和純合體判斷

Tab.2PCR amplification results of the samples and

homozygosis judgment

樣品TT51-1的Ct值PLD的Ct值△Ct值判斷123.4122.520.89純合224.1123.250.86純合324.4723.590.88純合424.7323.920.81純合525.0624.260.81純合624.7822.971.81雜合726.9626.300.67純合827.4925.691.81雜合924.9424.150.79純合1039.8624.4915.37非轉基因1125.6625.010.65純合1240.0823.9816.10非轉基因1326.6724.911.76雜合1425.5424.800.74純合1526.0924.291.80雜合1638.7024.5214.19非轉基因

a) 純合轉基因植株；b) 雜合轉基因植株；c) 非轉基因植株 圖1　水稻內標準基因PLD和TT51-1旁側序列實時熒光定量PCR擴增曲線 Fig.1　Amplification plots generated from amplification of rice endogenous reference gene PLD and TT51-1 event-specific flanking sequence

2.2標準曲線的繪制

在轉基因含量的分析研究中，常采用標準曲線法，將含量為100%的轉基因水稻TT51-1基因組DNA 5 倍梯度稀釋至100000，20000，4000，800，160，32 copies/μL，以稀釋后的6個濃度梯度DNA為模板進行熒光定量PCR，繪制內標準基因和旁側序列的標準曲線，反應設置4個平行.反應所得Ct值如表3所示，擴增曲線如圖2所示.內標準基因標準曲線的斜率為-3.5087，線性決定系數為0.992. 旁側序列標準曲線的斜率為-3.4417，線性決定系數為0.998. 根據歐盟轉基因網絡實驗室(European Network of GMO Laboratories，ENGL)對轉基因檢測方法中的要求，標準曲線的斜率應在-3.1～-3.6之間，代表PCR擴增效率在90%到110%之間，線性決定系數應大于0.98，說明實驗結果可靠、有效[6].本次試驗繪制的標準曲線均滿足相關要求，可用于轉基因含量的定量分析.

表3　水稻內標準基因 PLD和TT51-1轉化體事件

a, b ) PLD的擴增曲線和標準曲線； c, d) TT51-1的擴增曲線和標準曲線 圖2　水稻內標準基因PLD和TT51-1轉化體事件 特異性旁側序列標準曲線的繪制 Fig.2　Standard curves for PLD and TT51-1 real-time PCR systems

2.3樣品轉基因含量分析

在標準曲線繪制的同時，對表2中的16個單株抽取6份單株(分別為11～16號樣品)進行熒光定量PCR分析，并采用拷貝數百分比的方式計算轉基因含量，結果見表4.通過表4中外源基因與內標準基因的拷貝數的比值大致可將6棵植株分為3類：第一類拷貝數之比為0，說明這類水稻植株的基因組中未插入外源基因，第12、16號植株為非轉基因水稻；第二類拷貝數之比接近0.5，說明這類水稻的二倍體基因組中只有一條DNA雙鏈中插入了外源基因，而處于等位基因上的另外一條DNA雙鏈中未插入外源基因，即雜合體，故第13、15號植株為雜合轉基因水稻；第三類拷貝數之比接近1.0，說明這類水稻的等位基因上一對雙鏈DNA中均插入了外源基因，即等位基因上雙鏈DNA的旁側序列相同，故第11、14號植株為純合轉基因水稻.此法判斷結果與通過Ct值差值法的純合體鑒定結果一致，證明可以用Ct值差值法取代傳統的轉基因拷貝數百分比法來分析轉基因純合度.

3討論

在轉基因檢測標準物質的研制過程中，標準物質候選物是指可用于制備標準物質的材料，如轉基因植物和對應的非轉基因植物的籽粒、葉片等.在標準物質的研制過程中，需要大量的標準物質候選物.歐盟聯合研究中心下屬的標準物質與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)在研制轉基因玉米98140基體標準物質(編號BF427)時，以非轉基因玉米種子和轉基因玉米種子為起始材料[7].美國的油脂化學家學會(American Oil Chemists’Society，AOCS)在生產轉基因玉米T25基因組DNA標準物質(編號AOCS 0306-C)時，以2 mg非轉基因玉米和轉基因玉米T25的葉片DNA為起始材料[8].這些起始材料在生產的過程中均需要對純合度進行鑒定[9].

常規的純合度鑒定是采用熒光定量PCR分析作物內標準基因和旁側序列的拷貝數來計算轉基因含量.由于計算含量時需要繪制標準曲線，一次分析的樣品量有限，大大限制了標準物質候選物的純合度分析效率.本文以標準物質候選物的繁殖為基礎，以來自單株轉基因材料的種子為起始材料，根據遺傳分離定律，生長出來的植株只有非轉基因、轉基因雜合、轉基因純合3種情況.作物內標準基因的拷貝數恒定不變，外源基因的拷貝數可根據植株轉基因純合狀態分為3組[3].在熒光定量PCR分析中，用外源基因的Ct值減去內標準基因的Ct值，將樣品DNA濃度均一化.外源基因和內標準基因Ct值差值較大，說明外源基因拷貝數較少.故根據植株的3種情況，將△Ct值分為3組：若外源基因無擴增或Ct值超過38則為非轉基因；△Ct值較小的即為轉基因純合，△Ct值較大即為轉基因雜合，且轉基因雜合與轉基因純合△Ct值差值約為1.本方法快速、簡便、準確、可靠，大大提高了轉基因標準物質候選物的分析效率，為轉基因作物純合度研究提供了理論和技術基礎.

參考文獻

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