HPLC—ELSD法同時測定馬鈴薯中α－茄堿和α－卡茄堿含量

商婷婷 鄺夢婷 胡新喜，2 熊興耀，2 陸 英，3

（1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

馬鈴薯作為一種主要的經濟作物在世界范圍內廣為種植。馬鈴薯植株和塊根中含有一類甾體類糖苷生物堿，主要為α－茄堿和α－卡茄堿，在芽、幼葉、花、未成熟塊根以及成熟薯皮組織中含量均較高［1］。研究表明，這類糖苷生物堿在體內外均具有較強的毒性［2，3］，有抗腫瘤［4］、抗瘧［5，6］、強心［7］、抗病毒［8］、降脂［9］等多種功效，因此，在食品安全和醫藥開發中都具有重要意義。近年來的研究［10］還發現，這類生物堿對抵御病原菌和病蟲害等有一定的作用，能抑制和殺滅某些真菌、細菌等病原微生物，因此，作為綠色農藥的開發利用方面也具有廣闊前景。

蒸發光散射檢測器（ELSD）不依賴樣品的光學性質，任何揮發性低于流動相的樣品均能被檢測，近年來被廣泛用于低紫外吸收物質的檢測，同時ELSD對物理性質相似的物質可以給出一致的響應和標準曲線［11，12］，可在無對照品的情況下，采用另外一種結構相似、含量已知的物質作對照，從而測定未知物的含量［13］。目前對馬鈴薯中生物堿含量的測定主要采用高效液相色譜法（HPLC）［14－18］，在210nm 處進行紫外檢測（UV），由于分子內僅存在一個共軛雙鍵，屬于紫外末端吸收，溶劑對檢測的影響較大，基線不穩，特別是當樣品中生物堿含量低時，雜質干擾顯得尤為嚴重。同時，α－卡茄堿標準品價格昂貴且難以獲得，很多研究僅測定了α－茄堿的含量，缺乏對α－卡茄堿的研究報道。由于α－茄堿和α－卡茄堿具有相同的母核結構，分子結構極相似，本試驗擬以α－茄堿為標準品，建立HPLC—ELSD同時檢測馬鈴薯中兩種主要生物堿的方法，并對馬鈴薯不同部位含量進行測定，為馬鈴薯中生物堿安全評價及開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

α－茄堿標樣：純度為99%，北京百靈威有限公司；

乙腈：色譜純，美國天地公司；

馬鈴薯及莖葉材料：湖南農業大學湖南省馬鈴薯工程技術研究中心提供。馬鈴薯植株采于2014年5月中旬（品種：金湘），于地面上10cm處割下并分別制備莖、葉、葉柄、全株樣品，馬鈴薯削皮約2～3mm厚，肉皮分離，所有鮮樣切成小段或薄片，置60℃烘箱中干燥，粉碎，密閉后置冰箱備用。

1.2 儀器設備

高效液相色譜儀：LC－20A型，日本島津公司；

ELSD檢測器：ELSD－400型，美國SOFTA公司；

色譜柱：ZORBAX SB－C18（250mm×4.6mm，5μm），美國安捷倫公司；

旋轉蒸發儀：RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH型，金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC—ELSD分析條件 流動相 A：0.1%三氟乙酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脫：0～20min，25%～35%B；流速1mL/min，柱溫35℃，ELSD霧化管溫度30℃，漂移管溫度98℃，載氣壓力6.90kPa。

1.3.2 α－茄堿標準曲線制作 精密稱取α－茄堿標準品9.90mg用甲醇超聲溶解定容至10mL，制成0.98mg/mL的標準溶液，取5，10μL進樣，將該標準溶液用甲醇稀釋10倍后再取2，5，10，20μL，每個進樣體積重復進樣3次，測定并記錄峰面積，以進樣質量（μg）的對數為橫坐標（x），以化合物的平均峰面積的對數為縱坐標（y），繪制標準曲線，噪音3倍峰高質量為檢出線。

1.3.3 α－卡茄堿定量方法 由于ELSD檢測器對結構相似的物質具有相同的響應因子，因此具有相近的線性方程［11，12］，因此在無對標準品的情況下，可采用α－茄堿的標準曲線計算α－卡茄堿的含量。

1.3.4 樣品含量測定 精確稱取樣品1.0g，用100mL 1%甲酸甲醇于70℃回流提取90min，過濾，薯皮、薯葉提取液定容至100mL，其他部位提取液在50℃下濃縮，定容至25mL，得供試品溶液。樣液過膜，在1.3.1條件下進樣，根據標準曲線計算α－茄堿和α－卡茄堿含量。

2 結果與分析

2.1 HPLC—ELSD分析條件的確定

文獻［15～18］采用HPLC—UV法測定α－茄堿的流動相為H3PO4水溶液—乙腈，由于H3PO4不具揮發性，不能作為HPLC—ELSD的流動相，因此選用具有揮發性的三氟乙酸水溶液與乙腈為流動相，同時考慮到色譜柱的pH耐受值，確定水溶液中三氟乙酸的用量為0.1%。本試驗首先考察并優化了漂移管溫度、載氣壓力對色譜峰分離的影響，結果表明漂移管溫度升高，流動相蒸發趨于完全，信號響應值變大，但溫度過高，信號響應值變小，當漂移管溫度為98℃時信號響應值最大；載氣壓力不同使載氣流速不同，載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測器的響應，載氣壓力為6.90kPa時，噪聲信號小，色譜圖基線平穩，目標組分響應值高。同時通過洗脫梯度的調整，在1.3.1色譜條件下兩目標組分分離良好，根據標準物確定峰1為α－茄堿，根據文獻［14］確定峰2為α－卡茄堿，見圖1。

圖1 α－茄堿及馬鈴薯皮提取液的HPLC—ELSD圖譜Figure 1 HPLC—ELSD chromatogram ofα－solanine and the extract of potato skins

2.2 α－茄堿標準曲線繪制

按1.3.1方式進樣，以標準品質量對數為橫坐標x，峰面積對數為縱坐標y（圖2）得回歸方程為y＝1.207 9x＋4.807 0，r2＝0.999 5，α－茄堿在0.196～9.800μg線性關系良好。最低檢出限為0.098μg。

圖2 α－茄堿的標準曲線Figure 2 Standard curve ofα－solanine

2.3 馬鈴薯生物堿提取條件的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇 α－茄堿、α－卡茄堿屬于甾體類生物堿，只溶于甲醇、乙醇、吡啶等少數有機溶劑中，同時它們具有弱堿性，能在酸性條件下成鹽增加溶解度。文獻［14～16］均采用酸提堿沉等方式提取及凈化，本試驗采用提取液直接進樣，不需富集、凈化等復雜前處理，并考慮ELSD檢測器對進樣溶液的要求，以馬鈴薯皮為原料，首先考察不同溶劑的提取效果，由表1可知，提取溶劑甲醇優于乙醇，甲酸優于乙酸，1%甲酸甲醇對α－茄堿、α－卡茄堿提取效果均最好。

表1 提取溶劑比較Table 1 Comparison of extraction solvent mg/g

2.3.2 提取條件的確定 以馬鈴薯皮為原料，1%甲酸甲醇為提取溶劑，在單因素試驗的基礎上，對提取溫度、時間、溶劑用量進行三因素三水平的正交試驗，因素水平表見表2，結果見表3。由表3可知：馬鈴薯生物堿最佳提取條件為A3B3C3。即提取溫度70℃，提取時間90min，料液比1∶100（m∶V）。由極差分析可知：影響α－茄堿提取效果的因素依次為：時間＞溫度＞溶劑用量，影響α－卡茄堿提取效果的因素依次為：溶劑用量＞溫度＞時間，但均無顯著性差異（方差分析表略）。驗證實驗（表4）表明，正交分析得到最佳提取條件A3B3C3優于正交組中含量最高組合A3B3C2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal experiment results

表4 提取條件的驗證實驗Table 4 Verification test of extraction conditions（n＝2）mg/g

2.4 精密度試驗

取同一份樣品溶液重復進樣3次，記錄α－茄堿、α－卡茄堿面積，結果見表5。由表5可知：同一樣品重復進樣，RSD分別為1.13%，0.58%，說明儀器精密度良好。

表5 精密度試驗Table 5 Results of precision test

2.5 穩定性試驗

取同一份樣品溶液，分別于0，1，2，3，4h進樣，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結果見表6。由表6可知：樣品溶液在4h內穩定，RSD 分別為2.33%，2.94%。

表6 穩定性試驗Table 6 Results of stability test

2.6 重復性試驗

取馬鈴薯皮樣品，按方法分別制得供試品溶液3份，分別進樣測定，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結果見表7。由表7可知：峰面積RSD 分別為3.11%，1.10%，方法重現性好。

表7 重復性試驗Table 7 Results of repeated test

2.7 加標回收試驗

精密取已知含量的馬鈴薯皮原料3份各1.0g，精確加入α－茄堿標準品適量，按樣品制備方法提取并分析，結果見表8。由表8可知：α－茄堿的回收率在101.61%～97.44%，平均回收率為99.4%，RSD為1.1%，回收率高，達到測定要求。

表8 加標回收率試驗Table 8 Results of recovery test

2.8 樣品含量測定

按1.3.4方法制備馬鈴薯不同部位供試品溶液，平行制備2次，測定結果見表9。由表9可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，且兩種生物堿含量差異很大，α－茄堿的含量為0.13～1.59mg/g，由高到低為薯皮＞葉＞地上全株≈薯肉＞莖；α－卡茄堿的含量為0.39～8.28mg/g，由高到低為葉＞薯皮＞地上全株＞薯肉＞莖；兩種生物堿總量為0.52～9.37mg/g，同一部位中α－卡茄堿的含量是α－茄堿含量的1.2～7.6倍。

3 結束語

本試驗通過對提取條件的優化、檢測方法學考察等試驗建立了HPLC—ELSD測定馬鈴薯中兩種主要生物堿α－茄堿和α－卡茄堿的方法，樣品處理方法簡便，不需凈化直接進樣，目標組分的色譜峰形好，柱效高，分離度好。同時試驗基于ELSD檢測器對結構相似物質具有相同響應因子的特點，通過α－茄堿的標準曲線完成α－茄堿和α－卡茄堿的含量測定，對一些標準品缺乏的物質含量檢測具有一定的借鑒意義。

表9 馬鈴薯不同部位生物堿含量Table 9 Alkaloid content in different part of the potato plant（n＝2） mg/g

由試驗結果可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，葉、薯皮、地上全株部分含量較高，特別是馬鈴薯地上部分的產量遠大于馬鈴薯皮，因此以地上部分特別是葉作為原料進行糖苷生物堿的提取，并開發成為藥品、生物農藥等具有廣闊的前景，也可為農業資源廢棄物的深度開發利用開辟新的途徑。

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