膜分離與大孔樹脂聯用技術純化茶皂素

程文娟 謝海榮 秦 永 劉 蓉 鄧澤元

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

茶皂素是一類以齊墩果烷型五環三萜為母核、旁支帶有不同糖苷和官能團的皂苷化合物的總稱。它不僅具有抑菌、抗炎、止痛、降低血脂膽固醇等生物活性［1，2］，還有乳化、分散、潤濕、發泡、穩泡等性能，是一種優良的天然表面活性劑［3］，被廣泛應用于建材、化工、生物醫藥及食品等行業，應用前景十分廣闊。

由于茶皂素種類繁多，結構復雜且相似，同分異構體多，分離出單一結構的茶皂素純品異常困難，導致目前中國市場上所銷售的茶皂素產品的純度普遍不高，使其在醫藥及化妝品等精細化工行業的應用受到一定的限制。因此，高純度茶皂素的高效分離純化技術是油茶產業化過程中亟待解決的問題［4］。常見茶皂素的分離純化方法主要有正丁醇萃取法［5］、沉淀絮凝法［6］、鹽析法［7］、硅膠 柱層 析法［8］、大孔樹脂純化法［9］、膜分離法［10］等。但是這些方法都存在一些不足：采用正丁醇萃取法得到的茶皂素雜質較多［11］；沉淀絮凝法和鹽析法消耗試劑多，對環境造成污染；硅膠柱層析法對茶皂素易造成死吸附，產量低，不適用于工業生產等［12］。而膜分離法具有物質不發生相變、分離效果好、耗能低、工藝簡單、操作簡便、清潔無污染等優點；樹脂純化法具有穩定性高、選擇性好、條件溫和、低耗能、易于自動化、有利于環境保護等優點［13］。雖然已有單獨使用膜分離法、大孔樹脂純化法分離純化茶皂素的報道，但單獨使用膜分離法得到的產品純度不高，而單獨使用大孔樹脂法，存在耗時長等缺點。

本研究擬以茶粕中提取得到的粗茶皂素為原料，依次通過陶瓷膜和納濾膜進行初步分離，然后經大孔樹脂進一步純化，優化其工藝參數，以期得到純度較高的茶皂素，為實現茶皂素的工業化生產以及合理開發利用提供技術參考和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶粕：江西省高正生物科技集團有限公司；

茶皂素標品：阿拉丁試劑公司；

石油醚、乙醇、濃硫酸、香草醛：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

大孔 樹 脂：D101、NKA－2、AB－8、HPD450、HPD600、DM130、HPD－722、ADS－F8型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

大孔樹脂：Amberlite XAD7HP型，上海安瀾德生物科技有限公司；

大孔樹脂：HP20型，日本三菱樹脂株式會社。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計：722型，上海精密科學儀器有限公司；

膜分離純化儀器：實驗室型，上海朗極膜分離設備工程有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH－SII型，孔義市英峪華儀器廠；

多功能溢流循環超聲波萃取機：SJC－I－2L型，無錫市上佳生物科技有限公司；

電子天平：AR323CN型，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素標準曲線的確定 采用香草醛－濃硫酸法［14］。稱取0.0500g茶皂素標準品，用80%（V/V）乙醇水溶液將其溶于50mL容量瓶中，定容，搖勻，得到濃度為1mg/mL的茶皂素溶液。分別取0.0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mL于25mL具塞磨口試管中，超純水定容至2.5mL。再分別加入2.5mL 8%的香草醛乙醇溶液，移至冰水浴中，分別加入77%的硫酸水溶液（V/V）定容至25mL，搖勻，移入60℃恒溫水浴鍋中加熱40min，進行顯色反應。取出置于冰水浴中冷卻15min后，室溫放置10min。于550nm波長測定各反應液的吸光度值。

1.3.2 茶皂素的提取制備 將茶粕粉碎，過40目篩，用4倍石油醚加熱回流脫脂2h［15］，脫溶干燥。稱取一定量的脫脂茶粕，配制70%的乙醇溶液，按一定的料液比，用微波輔助超聲波法［16］提取得到茶皂素粗品。

1.3.3 試驗計算公式 膜分離試驗中，膜分離茶皂素的效果通過膜通量、茶皂素透過率和截留率來表示，分別按式（1）～（3）計算：

式中：

J——膜通量，L/（m2·h）；

V——取樣體積，L；

S——膜有效面積，m2；

t——取樣時間，h；

Ts——茶皂素透過率，%；

m1——膜濾液總皂苷含量，g；

m0——原料中總皂苷含量，g。

Ti——茶皂素截留率，%。

大孔樹脂的吸附和解吸效果通過吸附率和解吸率來表示，分別按式（4）～（7）計算：

式中：

Q——比吸附量，mg/g；

θ——吸附率，%；

P——比解吸量，mg/g；

γ——解吸率，%；

C0、C1——吸附前后樣品液中茶皂素的濃度，mg/mL；

C2——解吸附液中茶皂素的濃度，mg/mL；

V0——樣品體積，mL；

V1——解吸附液體積，mL；

M——樹脂濃度，g；

a——樹脂含水量，%。

1.3.4 膜分離純化茶皂素

（1）茶皂素濃度的選擇：稱取一定量茶皂素粗品溶于一定體積的70%乙醇水溶液中，配制成質量分數分別為1%，2%，3%，4%的茶皂素溶液，選取陶瓷膜采用全回流循環方式進行試驗，收集透過液，分別測定陶瓷膜膜通量、茶皂素透過率，以考察不同茶皂素濃度對膜分離效果的影響［17］。

（2）膜元件的選擇：稱取一定量茶皂素粗品溶于一定體積的70%乙醇水溶液中，配制成1%的茶皂素溶液，選取陶瓷膜、微濾膜（10.0，5.0，3.5kDa）、納濾膜（360Da）進行試驗，收集透過液，分別測定茶皂素透過率［18］。

1.3.5 大孔樹脂的選擇 所選擇的10種大孔樹脂的物理性質：XAD7HP、HPD600、NKA－2、ADS－F8為極性大孔樹脂；DM130、HPD450為中極性大孔樹脂；HPD－722、AB－8為弱極性大孔樹脂；HP20、D101為非極性大孔樹脂。其平均孔徑以XAD7HP大孔樹脂最大，為45，ADS－F8為無孔樹脂，其他為80～100。比表面以 NKA－2為最大，達到1 200m2/g，其于大孔樹脂比表面為350～600m2/g。

（1）靜態吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選：① 靜態吸附試驗：根據大孔樹脂的物理性質，選取10種大孔樹脂進行靜態吸附篩選試驗。分別稱取5g已預處理的大孔樹脂［19］，置于帶塞錐形瓶中，加入6g/L的茶皂素水溶液50mL，置于25℃恒溫培養箱中，調節轉速為1 200r/min，靜態吸附6h，每隔一定時間取一定體積的樣液，測定其茶皂素含量，計算茶皂素的吸附率，比吸附量，并繪制茶皂素靜態吸附動力學曲線。②靜態解吸試驗：將上述吸附完全的大孔樹脂用蒸餾水洗凈，置于帶塞錐形瓶中，加入70%的乙醇50mL進行大孔樹脂解吸，將其置于25℃恒溫培養箱中，調節轉速為1 200r/min，靜態解吸6h，測定其上清液中茶皂素的含量，計算茶皂素的解吸率，比解吸量［13］。

（2）動態吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選：① 動態吸附試驗：分別稱取20g已處理好的大孔樹脂，濕法裝柱，加入30mg/mL的茶皂素溶液50mL，靜置2h，用蒸餾水沖洗樹脂柱，直至流出液呈無色透明，收集流出液，并測定總流出液中的茶皂素濃度。計算樹脂的吸附率、比吸附量。② 動態解吸試驗：將上述充分吸附后的樹脂分別用70%乙醇溶液以相同的流速進行洗脫，收集濾液，測定洗脫液中茶皂素的濃度，計算解吸率和比解吸量。

1.3.6 大孔樹脂純化茶皂素的條件優化 根據大孔樹脂靜態和動態吸附試驗的篩選結果，選擇效果最好的大孔樹脂用于茶皂素純化。通過考察不同的上樣濃度和上樣流速對茶皂素吸附率的影響，不同的洗脫劑（乙醇）濃度、洗脫劑流速和洗脫劑體積對茶皂素解吸率的影響，來優化大孔樹脂純化茶皂素的條件。

1.3.7 大孔樹脂對茶皂素的純化 稱取100g已預處理好的大孔樹脂，濕法裝柱，用95%乙醇沖柱，然后用蒸餾水沖洗至無醇味。將上述經過膜分離初步純化得到的茶皂素，配成濃度為30mg/mL的水溶液，以0.5mL/min流速上樣250mL，待上樣結束后靜置2h，使其吸附完全。用蒸餾水洗至流出液呈無色，然后用已優化的大孔樹脂純化茶皂素的條件，進行茶皂素的純化，計算茶皂素的得率和純度。

1.4 數據處理

所有試驗重復3次，采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，試驗數據均以珚x±s表示，使用ANOVA方差分析進行多組間差異顯著性檢驗，使用t檢驗法進行組間比較，當P＜0.05，認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 茶皂素標準曲線

以吸光度為縱坐標，茶皂素的濃度為橫坐標繪制茶皂素標準曲線（圖1），回歸方程為：y＝0.481 8x－0.005 9，R2＝0.999 6。

2.2 膜分離純化茶皂素

圖1 茶皂素標準曲線Figure 1 Standard curves of tea saponin

2.2.1 茶皂素濃度的選擇 由圖2可知，隨著茶皂素濃度的增大，茶皂素的透過率和膜通量均降低，當茶皂素濃度從1%增加到2%時，透過率從72.67%急劇下降至33.69%；茶皂素濃度繼續增加，下降趨勢變平緩。在膜分離過程中，溶質被膜截留，在濾膜表面積累，導致溶質在濾膜表面的濃度逐漸高于溶液主體中的濃度，在濃度梯度的作用下，溶質由膜表面向本體溶液擴散，從而形成邊界差，使流體阻力與局部滲透壓增大，導致膜通量降低。當溶劑向膜面流動時，溶質向膜面流動的速度與濃度梯度使溶質向本體溶液擴散的速度達到平衡時，在膜面形成濃差極化邊界層，該現象稱為濃差極化。高濃度時，容易形成多層吸附，同時也會導致濃差極化的加劇，會增加透過阻力，增加系統的運行壓力，嚴重時會導致結晶析出，阻塞流道，從而導致膜通量降低和系統運行惡化，影響膜分離的效果［19］。此外，由于三萜類皂苷具有表面活性劑的性質，在溶劑中會締合形成膠束［20］，當溶液超過某一濃度時，膠束形成，粒徑變大，從而影響膜分離的效果。因此在進行膜分離純化時，宜選擇較低濃度的茶皂素進行粗分離。

圖2 陶瓷膜對不同濃度茶皂素的分離效果Figure 2 The purification effect of tea saponin under different concentration

2.2.2 膜元件的選擇 按分離過程，膜分離可分為微濾、超濾、納濾、反滲透、滲析、電滲析、氣體分離、滲透蒸發、液膜等不同的類型，其中微濾、超濾和納濾為常見的依靠壓力差為推動力的分離方式，操作簡單，耗能低，易于工業化應用。茶皂素的平均分子量為1.2kDa左右，根據其特性及其粒徑大小，選 擇 微 濾（陶 瓷 膜）、超 濾 （10.0，5.0，3.5kDa）、納 濾（360Da）3種類型的膜元件來分離茶皂素，以獲得最優的膜分離效果。將濃度為1%的茶皂素溶液分別通過不同類型和孔徑的膜，其茶皂素透過率和截留率的結果見圖3。試驗結果表明，72.67%的茶皂素能夠透過陶瓷膜；使用超濾膜時，茶皂素的透過率很低，并且隨著膜孔徑的減小，透過率降低，截留率升高；使用納濾膜時，茶皂素的透過率為零。該試驗結果與趙敬娟等［17］的一致，即孔徑越小，對粒子或溶質的截留率越高。根據膜分離原理，陶瓷膜可以截留大部分的蛋白質等大分子雜質，通過收集透過液即可達到純化目的，而360Da的納濾膜可以透過水、無機鹽等小分子物質，通過收集納濾的截留液可以達到濃縮的目的，因此選取陶瓷膜和納濾膜相結合的方式純化茶皂素。取經陶瓷膜分離的茶皂素透過液2 600mL，經360Da納濾濃縮得到濃縮液750mL，濃縮倍數為3.5倍，濃縮試驗歷時22min。膜純化后濃縮液經噴霧干燥得到淡黃色粉末狀的茶皂素，其得率為62.1%，純度為79%。

圖3 不同的膜對茶皂素的純化效果Figure 3 The purification effet of tea saponin by different membrane

2.3 大孔樹脂的選擇

2.3.1 靜態吸附茶皂素用大孔樹脂篩選 不同的大孔樹脂因材質、極性強弱、孔徑大小、比表面積等物理性質不同，其對同種物質的吸附純化效果也不同。試驗中所選取的10種大孔樹脂，涵蓋范圍較廣，能夠初步考察不同極性、孔徑、比表面積的大孔樹脂對茶皂素純化效果的影響，結果見圖4。由圖4可知，XAD7HP、HPD－600、AB－8、HP－20 4種大孔樹脂對茶皂素的吸附和解吸作用良好，吸附率和解吸率均達到85%以上，其中以XAD7HP大孔樹脂最高，吸附率和解吸率分別高達92%和94%，即經純化后的茶皂素的得率（吸附率×解吸率）最高，為86.48%。

圖4 不同大孔樹脂對茶皂素的純化效果Figure 4 The purification effet of tea saponin by different membrane

選取效果較好的4種大孔樹脂繪制靜態吸附動力學曲線，見圖5。由圖5可知，4種大孔樹脂在0.5h內吸附速度最快，隨著時間的推移，吸附速度逐漸變緩，最后趨于平衡，為典型的langmuir吸附等溫線，屬于單分子層吸附［8，21］。

圖5 靜態吸附動力學曲線Figure 5 The curve of static adsorption kinetics

2.3.2 動態吸附茶皂素用大孔樹脂的篩選 由于大孔樹脂對物質的動態吸附和靜態吸附存在一定差異，并且在實際的試驗和生產過程中，都是采用動態吸附洗脫方式，所以采用動態吸附法進一步篩選大孔樹脂。以靜態吸附試驗篩選出的效果較好的4種大孔樹脂，進行動態吸附篩選試驗，結果見圖6。

圖6 大孔樹脂動態吸附篩選試驗Figure 6 The screening experiment of macroporous resin dynamic adsorption

由圖6可知，XAD7HP大孔樹脂吸附率和解吸率分別高達70.81%和90.62%，均高于其他3種大孔樹脂，茶皂素的得率最高，為64.17%。結合靜態吸附篩選試驗可知，XAD7HP型大孔樹脂用于茶皂素的純化，效果最佳。

大孔樹脂的吸附作用是依靠樹脂和被吸附的分子之間的范德華引力，通過樹脂巨大的比表面進行物理吸附，根據有機物吸附力和分子量大小經一定溶劑洗脫而達到分離純化、除雜的目的。茶皂素的平均分子量為1 200Da左右，極性強，易溶于熱水、甲醇水溶液、乙醇水溶液中。根據相似相容原理以及大孔樹脂吸附原理，適宜選用極性大，孔徑大，比表面大的大孔樹脂。XAD7HP屬于極性大孔樹脂，比表面積大，平均孔徑較大，適宜分離純化茶皂素。

2.4 大孔樹脂純化茶皂素的條件優化

2.4.1 上樣液濃度對吸附效果的影響 由圖7可知，隨上樣液濃度的增加，吸附率先增加后減小，濃度為30mg/mL時吸附率最大。當上樣液濃度過低時，茶皂素與大孔樹脂之間的吸附不充分，造成吸附率低；而上樣液濃度過高時，溶液中雜質濃度升高，與茶皂素在樹脂上競爭吸附，同時濃度過高時，溶液易產生沉淀，影響其吸附率［22］。因此茶皂素濃度為30mg/mL時吸附效果最佳。

圖7 茶皂素濃度對吸附效果的影響Figure 7 The adsorption effect of the tea saponin concentration

2.4.2 上樣流速對吸附效果的影響 由圖8可知，流速為0.5mL/min時，茶皂素與大孔樹脂的吸附時間充足，吸附率最高；隨著流速增加，茶皂素與大孔樹脂的接觸時間減少，吸附率逐漸降低，吸附效果變差。因此選用0.5mL/min的流速進行上樣。

圖8 上樣流速對吸附效果的影響Figure 8 The adsorption effect of the sample flow rate

2.4.3 洗脫劑濃度對解吸效果的影響 由圖9可知，隨著乙醇濃度增大，解吸率增加，當乙醇濃度為70%，80%，90%時，解吸率幾乎不變，均為92%左右，對茶皂素洗脫效果較好，結合成本考慮，選用70%乙醇進行洗脫。乙醇濃度為10%時，茶皂素的洗脫率低，色素等水溶性較好的雜質首先被洗脫去除；乙醇濃度達到40%時，洗脫率增加至43.96%，部分茶皂素被洗脫；乙醇濃度為70%時，茶皂素基本洗脫完全。綜合考慮，選取10%，40%，70%的乙醇進行梯度洗脫，可以去除大部分雜質，得到較高純度的茶皂素。

圖9 洗脫液乙醇濃度對解吸效果的影響Figure 9 The desorption effect of ethanol concentration

2.4.4 洗脫劑洗脫流速對解吸效果的影響 由圖10可知，隨著洗脫劑流速的增加，洗脫率呈現先增加后降低的趨勢。洗脫流速為1mL/min時，洗脫率最大，洗脫效果較為理想。洗脫流速增大，乙醇與大孔樹脂吸附的茶皂素之間的作用時間減少，影響其解吸效果，但流速過慢，增加洗脫時間，將影響茶皂素解吸效率。

2.4.5 洗脫液體積對解吸效果的影響 大孔樹脂洗脫時，洗脫劑的體積越大洗脫效果越好，但成本也相應增加。由圖11可知，洗脫劑用量為3BV時，茶皂素洗脫率已高達93%，洗脫劑用量繼續增加，洗脫率增加幅度很小，所以3BV的洗脫劑量最為適宜。

圖10 洗脫液流速對解吸效果的影響Figure 10 The desorption effect of eluent flow rate

圖11 洗脫液體積對解吸效果的影響Figure 11 The desorption effect of eluent volume

2.5 大孔樹脂對茶皂素的純化

采用優選出的XAD7HP大孔樹脂以流速0.5mL/min、茶皂素濃度30mg/mL上樣，以10%，40%，70%的乙醇各3BV，在流速1mL/min下進行梯度洗脫，收集40%和70%乙醇的洗脫液，濃縮、干燥后得到白色粉末狀茶皂素，其得率為55.3%，純度為95%。

3 結論

本試驗采用膜分離和XAD7HP大孔樹脂聯用技術來純化茶皂素，其得率和純度均高于張新福［17］通過膜分離和AB－8大孔樹脂純化茶皂素的研究結果。同時結果表明，膜分離法與樹脂聯用技術純化茶皂素時，無需添加其他化學試劑，無污染，生產過程簡單，成本低，效率高，易于連續化生產，是一種可工業化推廣的方法。

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