酸漿水中3種菌株的產酸能力及抗氧化活性

劉 力 李 理

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640)

豆腐黃漿水為豆腐制作過程中產生的黃色瀝水，含有大量水蘇糖、棉子糖等低聚糖，同時還含有蛋白質、大豆異黃酮及維生素P、K等營養物質，非常適合微生物的生長［1－3］。豆腐黃漿水在存貯的過程中自然發酵成為酸漿水，是一種良好的豆腐凝固劑，已在腐乳行業廣泛應用［4］。自然發酵的酸漿中含有大量的乳酸菌、酵母及其他微生物，其中也可能含有有害微生物如蠟樣芽孢桿菌［4］，因此，采用純種發酵制備有利于提高酸漿的品質及安全性。

本課題組前期研究了鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵豆腐黃漿水并取得了良好的效果［5］，考慮到自然發酵形成的酸漿中可能包含有性能更優越的菌種，近期又研究了酸漿水中的微生物，并從中分離出2株解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus L5、Lactobacillus amylolyticus L6)［6，7］和 1 株阿米塞畢赤氏酵母(Pichia amethionina Y)。本研究探討了3個菌株單菌、或者組合發酵豆腐黃漿水的產酸能力，以及酸漿水的抗氧化能力。另外，考慮到豆腐黃漿水中富含異黃酮［1，2］，且乳酸菌發酵能增強食物體系的抗氧化能力［8］，本研究分別應用FRAP法、DPPH法以及螯合Fe2+相結合的方法［9］從不同的方面研究和評價酸漿水的抗氧化活性，為綜合利用豆腐黃漿水提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

改良MRS液體培養基:牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO4·3H2O 2 g，NaAc·3H2O 5 g，檸檬酸氫二銨2 g，MgSO4·7H2O 0 .58 g，MnSO4·H2O 0.25 g;加蒸餾水定容到1 L，pH 6.4 ±0.2，121 ℃滅菌15 min。

豆腐黃漿水:從廣東某腐乳廠采集;

菌種:Lactobacillus amylolyticus L5菌種保藏號為CGMCC NO.9371，Lactobacillus amylolyticus L6 保藏號為 CGMCC NO.9090，分離源為自然發酵的豆腐酸漿，經16SrDNA分子鑒定確定菌種名;Pichia amethionina Y，分離源為同一自然發酵的豆腐酸漿，經26SrDNA分子鑒定及生理生化試驗確定菌種名;

TPTZ、DPPH、菲洛嗪和生育酚:美國Sigma公司;

其他試劑:均為國產分析純;

pH計:PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司;

紫外分光光度計:UV230型，上海天美科學儀器有限公司;

電子天平:AL204-IC型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:LDZX-30KBS型，上海申安醫療器械廠;

超凈工作臺:SZX型，吳江凈化設備總廠;

電熱恒溫培養箱:DHP-9052型，上海申賢恒溫設備廠;

高速冷凍離心機:CR22G型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵劑的制備 在無菌環境下把活化好的解淀粉乳桿菌Lactobacillus amylolyticus L5、L6以及阿米塞畢赤氏酵母Pichia amethionina Y分別接入到121℃滅菌15 min的MRS液體培養基中和115℃滅菌15 min的麥芽汁液體培養基中，35℃培養24 h后即為母發酵劑。母發酵劑在豆腐黃漿水培養基(豆腐黃漿水經8 000×g離心10 min去除不溶物即得)中轉接2～3次即可作為工作發酵劑。

1.2.2 阿米塞畢赤氏酵母、解淀粉乳桿菌及其復合模式發酵豆腐黃漿水樣品的制備 豆腐黃漿水經8 000×g離心10 min去除不溶物后，分裝于1.8 cm×20 cm試管中，使液體高度達到18 cm，用橡膠塞緊塞，作為培養基。121℃滅菌15 min，在無菌環境中按6%(V/V)的添加量分別接入解淀粉乳桿菌L5、L6和阿米塞畢赤氏酵母Y的工作發酵劑，編號分別標為L5，L6，Y。酵母菌和解淀粉乳桿菌復合發酵豆腐黃漿水的樣品標號分別為L5+Y(3%L5+3%Y)、L6+Y(3%L6+3%Y)、L5+L6+Y(2%L5+2%L6+2%Y)。在 35℃下恒溫培養 0，12，24，36，48，60 h 后。放置于 －20 ℃冰箱中待用。

1.2.3 pH值和酸度值的測定 使樣品恢復室溫，直接用測定樣品的pH值;采用GB 5413.34—2010方法測定酸度值，用涅爾度(oT)表示。

1.2.4 酸漿水對Fe3+的還原能力(FRAP) 根據文獻［10］略有改動。使用0.04 mol/L的HCl溶液配制TPTZ溶液(10 mmol/L)。將2.5 mL 的 TPTZ 溶液，2.5 mL 的 FeCl3溶液(20 mmol/L)和25 mL的乙酸鹽緩沖液(300 mmol/L，pH 3.6)混合，制備得到FRAP溶液。取100 μL各類樣品加入3 mL的FRAP溶液，在37℃下靜置10 min，于8 000×g離心10 min，于593 nm處測定吸光度值。將生育酚(Trolox)作為標準物質。通過標準曲線 y=0.001 1x+0 .068 7，r2=0.999 3(y.吸光值;x.Trolox濃度，mmol)將酸漿水還原Fe3+的能力表示為mmol Trolox/mL樣品。

1.2.5 酸漿水清除DPPH·自由基能力 根據文獻［11］略有改變。分別取各類樣品2 mL與2 mL DPPH(0.2 mmol/L，無水乙醇)溶液充分混合。在黑暗室溫條件下反應30 min后，于8 000×g離心10 min，期間注意避光。在517 nm處測定吸光值。去離子水作為對照，生育酚(Trolox)作為標準物質。通過標準曲線 y= －0.012 6x+1.096 2，r2=0.999 6(y.吸光值;x.Trolox濃度，μmol)將酸漿水清除DPPH·自由基能力表示為μmol Trolox/mL樣品。

1.2.6 酸漿水對Fe2+的螯合作用 根據文獻［12］略有改動。樣品經過8 000×g離心10 min，量取3 mL各類樣品，與50 μL現配FeCl2(2 mmol/L)水溶液充分混勻，室溫下靜置1 min。加入100 μL的菲咯嗪溶液(5 mmol/L)混合均勻。去離子水作為對照，在室溫下反應20 min，562 nm測定吸光值。樣品的Fe2+螯合能力表示為螯合率，按式(1)計算:

式中:

C——螯合 Fe2+能力，%;

Ac、Asi——分別為對照樣和各類樣品的吸光值;

Ai——不添加菲咯嗪時各類樣品的吸光度值。

1.2.7 數據處理與分析 采用SPSS 17.0軟件分析處理試驗數據。試驗數據表示為“平均值±標準偏差”的形式，顯著性差異設置水平為P=0.05。

2 結果與討論

2.1 酸漿水的酸度和pH

由圖1、2可知，在單菌種發酵模式下，解淀粉乳桿菌L5和L6均可發酵豆腐黃漿水產酸，其中L6的產酸更強，而阿米塞畢赤氏酵母Y基本不產酸。解淀粉乳桿菌L5、L6在發酵豆腐黃漿水初期的12 h內(35℃)，菌種處于對數生長期，產酸能力強，pH值下降快，隨著發酵時間的延長，產酸速率有所下降，L5在發酵48 h時產酸量達到最大，其后趨于平穩;L6的產酸能力更強，酸度值一直處于上升的趨勢，在發酵60 h后酸漿的pH為3.74，酸度值達到65.11oT。由此可見，這2株解淀粉乳桿菌在沒有補充任何營養成分的情況下［5］，能夠在豆腐黃漿水中迅速生長產酸，具有很好的應用前景。對于乳酸菌而言，pH值下降可能是菌株代謝活性和生長的需要［13］，但對于酸漿水來說，pH值的下降可以抑制腐敗菌和病原微生物的生長［5］，對酸漿的安全性具有重要意義。

圖1 酸漿水的酸度值Figure 1 The titratable acidity of fermented tofu whey

圖2 酸漿水的pH值Figure 2 The pH of fermented tofu whey

由于阿米塞畢赤氏酵母不產酸，因此L5+Y以及L6+Y這樣的雙菌種組合發酵豆腐黃漿水的產酸能力下降是可以理解的。但值得關注的是，L5+L6+Y這樣3個菌株的組合在發酵豆腐黃漿水48 h時，其產酸仍然持續增加，接近或超過L5和L6的產酸能力，在發酵60 h時其酸度值達到65.44oT，超過單菌種發酵的酸度值，表明菌種L5和L6之間可能存在一種共生作用，需要進一步研究。

2.2 酸漿水的抗氧化活性

2.2.1 還原Fe3+的能力(FRAP) 在低pH條件下，抗氧化物質可以把復合物Fe3+—TPTZ還原為Fe2+—TPTZ，同時會顯示深藍色，在593 nm處有最大的吸收峰［10］，該FRAP方法快速、簡單，結果重現性好，與抗氧化物質的摩爾濃度有較強的線性關系。由表1可知，在單菌株發酵模式下，豆腐黃漿水經解淀粉乳桿菌以及阿米塞畢赤氏酵母發酵后，其還原Fe3+的能力均顯著增強;在組合發酵模式下，酸漿水還原Fe3+的能力優于單菌種發酵模式，其中L5+L6+Y組合發酵制備的酸漿水擁有最強的還原Fe3+能力，35℃發酵24 h后達到5.53 mmol Trolox/mL，此后繼續發酵則還原Fe3+能力逐漸回落。由此可見，解淀粉乳桿菌及阿米塞畢赤氏酵母發酵豆腐黃漿水均可顯著增強其還原能力。

表1 酸漿水還原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

表1 酸漿水還原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

不同大寫字母表示同行數據之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數據之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 4.56 ±0.05Ca 4.68 ±0.04Bd 4.99 ±0.06Ad L6 4.76 ±0.11Ba 4.93 ±0.05Ac 5.02 ±0.05Ad Y 4.71 ±0.08Ba 4.84 ±0.05Bc 5.14 ±0.10Ac L5+Y 4.58 ±0.01Ca 5.21 ±0.04Ab 5.10 ±0.04Bc L6+Y 4.70 ±0.08Ba 5.29 ±0.07Ab 5.22 ±0.05Ab L5+L6+Y 4.66 ±0.11Ba 5.53 ±0.06Aa 5.44 ±0.06Aa

從已有的報道［13－16］來看，很多菌種都可以通過發酵作用增強豆類制品的抗氧化能力，如黑豆經過曲霉、芽孢桿菌和酵母發酵后其還原Fe3+的能力明顯提高［14］，鷹嘴豆經冬蟲夏草發酵后其還原Fe3+的能力也明顯提高［15］。Vadivel等［16］認為還原Fe3+能力的增加與總的游離多酚物質含量增加有關，游離多酚含量越高，生成的Fe2+—TPTZ復合物越多。Xiao等［13］的研究發現，當應用植物乳桿菌發酵豆腐黃漿水時，酸漿水中苷元型異黃酮含量以及總酚明顯增加，且其還原Fe3+的能力也明顯增強。由此可見，解淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母可能都有釋放游離酚的能力。

2.2.2 酸漿水清除DPPH自由基能力 由表2可知，在單菌種發酵模式下，解淀粉乳桿菌發酵豆腐黃漿水對增強清除DPPH自由基能力沒有顯著效果，但豆腐黃漿水經過阿米塞畢赤氏酵母Y發酵以后，清除DPPH自由基能力顯著提高，擁有最強的清除DPPH自由基能力，35℃發酵48 h后，達到38.49 μmol Trolox/mL;在多菌種組合發酵模式下，酸漿水清除DPPH自由基的能力均有所增強，且隨著發酵時間的延長，清除能力增強，其中，L5+Y組合發酵制備的酸漿水擁有較強的清除DPPH自由基的能力。綜合比較，解淀粉乳桿菌對提高豆腐黃漿水清除DPPH自由基的能力不顯著，阿米塞畢赤氏酵母發酵豆腐黃漿水能夠顯著提高其清除DPPH自由基的能力，多菌種組合發酵模式下清除能力有所下降。

表2 酸漿水清除DPPH自由基的能力Table 2 DPPH radical scavenging activities of fermented tofu whey (μmol Trolox·mL－1)

不同大寫字母表示同行數據之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數據之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 32.38 ±0.10Ac 32.22 ±0.18Ae 31.84 ±0.06Bf L6 32.64 ±0.05Bc 32.80 ±0.10ABd 32.95 ±0.13Ae Y 34.19 ±0.08Ca 36.65 ±0.14Ba 38.49 ±0.14Aa L5+Y 34.03 ±0.15Ba 34.20 ±0.18Bb 36.54 ±0.20Ab L6+Y 33.31 ±0.14Cb 33.82 ±0.14Bc 34.94 ±0.17Ad L5+L6+Y 33.49 ±0.08Cb 34.11 ±0.14Bb 35.87 ±0.08Ac

有研究［17］指出，清除DPPH自由基的能力與化學物質自身的組成和結構有很大關系，分子大小合適、含有羥基基團、能夠提供電子的抗氧化物質，可以快速地清除DPPH自由基。陳歷水等［18］的研究表明，畢赤氏酵母細胞具有較好的清除DPPH自由基能力;酵母細胞本身所含有的抗氧化物質(如SOD酶和CAT酶等)、分泌的一些能抑制氧化的物質以及其細胞壁上的多糖蛋白均具有較好的抗氧化能力［19］。

2.2.3 螯合Fe2+的能力 有研究［20］表明，過渡金屬參與生物體內的多種氧化反應，如Fe2+可以誘導超氧陰離子形成危害更大的羥基自由基，通過抗氧化物質螯合金屬離子被認為是清除羥基自由基最有效的方式。由表3可知，在單菌種發酵模式下，L6和Y發酵制備的酸漿水對Fe2+的螯合能力隨著發酵時間的延長而增強，其中L6發酵制備的酸漿水表現出最強的螯合Fe2+能力，螯合率達到54.45%。值得關注的是，L5雖然也是解淀粉乳桿菌，但其發酵制備的酸漿水螯合Fe2+的能力卻隨著發酵時間的延長而降低，表現出與L6完全不同的結果。在多菌種組合發酵模式條件下，L5+L6+Y發酵制備的酸漿水的螯合力并不比L6+Y發酵制備的酸漿水螯合力差，表明L6和L5之間可能有某種共生或互生關系。螯合Fe2+能力的強弱與化合物的結構有很大的關系，結構中含有兩個或多個羥基、羰基、巰基、羧基等官能團時，螯合金屬離子的能力會顯著增強［17］，解淀粉乳桿菌L6和L5在螯合Fe2+方面表現出的截然不同的能力有待進一步的研究，可能與這兩個菌種對豆腐黃漿水中抗氧化物質的生物轉換能力不同有關。

表3 酸漿水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

表3 酸漿水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

不同大寫字母表示同行數據之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數據之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 35.33 ±1.53Aa 21.54 ±0.25Bf 15.11 ±0.21Ce L6 34.95 ±0.30Cab 51.21 ±0.18Ba 54.45 ±0.36Aa Y 34.72 ±0.86Bab 38.72 ±0.45Ac 39.00 ±0.25Ac L5+Y 35.46 ±0.32Aab 31.35 ±0.30Be 24.56 ±0.43Cd L6+Y 34.32 ±1.02Cb 36.44 ±0.60Bd 44.75 ±0.85Ab L5+L6+Y 34.31 ±0.18Bb 44.33 ±0.23Ab 44.17 ±0.24Ab

綜合抗氧化試驗結果，豆腐黃漿水本身就具有抗氧化能力，這主要是由于豆腐黃漿水中富含異黃酮、小分子蛋白、低聚糖等抗氧化成分，而發酵作用可促進糖苷型大豆異黃酮轉化為活性更強的游離苷元型大豆異黃酮，從而提高酸漿水的抗氧化活性［13］，不過，不同的菌種在抗氧化能力方面表現出較大的差異。

由于解淀粉乳桿菌L5和L6發酵豆腐黃漿水具有優越的產酸能力，同時L5+L6+Y組合發酵制備的酸漿水具有良好的抗氧化活性，因此，不僅可以利用解淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母發酵制備豆腐凝固劑，也可以利用這種發酵作用制備風味良好的功能性飲料。

3 結論

(1)解淀粉乳桿菌L5和L6均可在天然的豆腐黃漿水中生長產酸，其中菌株L6的發酵產酸能力更強，35℃發酵60 h后，酸度達到65.11oT，此外，3個菌株組合發酵時也有較強的產酸能力，在發酵60 h后，酸度也達到65.44oT，可根據生產實際選擇不同的菌種來制備豆腐凝固劑。

(2)豆腐黃漿水經過解淀粉乳桿菌L6發酵后，還原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力略有增加，但螯合Fe2+的能力顯著增強，在發酵48 h時達到54.45%;與L6不同，解淀粉乳桿菌L5發酵制備的酸漿水螯合Fe2+的能力隨著發酵時間延長而明顯下降;阿米塞畢赤氏酵母Y發酵制備的酸漿水具有良好的還原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力以及螯合Fe2+的能力;當3個菌株組合發酵時，其產酸能力以及酸漿水還原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力和螯合Fe2+的能力均比L6+Y雙菌株發酵制備的酸漿水強，菌株之間可能有一定的相互促進作用。

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