不同產(chǎn)地枸杞中主要類胡蘿卜素的聚類分析

曲云卿 張同剛 劉敦華

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

枸杞又名枸杞子、杞子、枸牙子，是茄科茄亞科枸杞族枸杞屬植物。中國主要分布在寧夏、新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古等地，其中寧夏枸杞最著名［1］。枸杞作為藥食同源植物［2］，已被廣泛用在食品工業(yè)中。目前中國市場上已開發(fā)出枸杞酒、枸杞飲料、枸杞保健品等產(chǎn)品［3，4］。

不同產(chǎn)地的枸杞的品質差異很大。其理化成分、營養(yǎng)成分和生理活性成分的含量存在差異［5］，其價格也有較大差異。但有一些商家為了追求更高的利潤，將不同產(chǎn)地枸杞進行混摻、摻假，嚴重損害了消費者的利益。因此，有必要對不同產(chǎn)地的枸杞的有效成分進行比較和分析。

類胡蘿卜素是枸杞中的主要色素，也是枸杞中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤等作用。枸杞果實中含有β-胡蘿卜素、玉米黃素和多種類胡蘿卜素酯，其中玉米黃素雙棕櫚酸酯是枸杞中含量最高的類胡蘿卜素［6］。β-胡蘿卜素具有維生素A的活性，玉米黃素具有多種生理功能，如抗氧化、清除自由基、保護視力等［7，8］。目前，對于枸杞中類胡蘿卜素的研究主要集中在類胡蘿卜素的提取方法優(yōu)化［9］，不同成熟期枸杞類胡蘿卜素的變化上［6］，因此本研究將對不同產(chǎn)地的枸杞中類胡蘿卜素的比較分析作為研究內(nèi)容。

本研究擬采用分光光度法和高效液相色譜法測定新疆、甘肅、南梁、中寧、惠農(nóng)、內(nèi)蒙、固原、青海8個不同產(chǎn)地的枸杞干果中的類胡蘿卜素總量、β-胡蘿卜素、玉米黃素和玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量，并進行聚類分析。旨為今后區(qū)分不同產(chǎn)地枸杞，提高枸杞質量提供一些技術參考，同時對指導枸杞種植以及建立枸杞質量標準有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

枸杞:2014年分別從新疆精河、甘肅白銀、南梁、中寧、惠農(nóng)、內(nèi)蒙烏拉特前旗先鋒鎮(zhèn)、固原、青海柴達木8個產(chǎn)地取得枸杞干果作為樣品。在當?shù)胤N植園采摘，每個產(chǎn)地隨機取500 g樣品，烘干，裝入自封袋備用。

丙酮、石油醚:分析純，天津市大茂化學試劑廠;

無水硫酸鈉:分析純，煙臺市雙雙化工有限公司;

甲醇、正己烷、二氯甲烷:色譜純，天津市大茂化學試劑廠;

乙腈:色譜純，天津市光復精細化工研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電熱鼓風恒溫干燥箱:101-3型，上海東星建材試驗設備有限公司;

高效液相色譜儀:AGILENT 1100型，配有自動進樣器，安捷倫公司;

色譜柱:ZORBAX Edipse XDB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫公司;

集熱式恒溫磁力攪拌器:DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司;

旋轉蒸發(fā)器:RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠;

離心機:Cence-L550型，湘儀離心機儀器有限公司;

循環(huán)水式多用真空泵:SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;

電子天平:AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

紫外可見分光光度計:T6新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 枸杞樣品前處理 將不同產(chǎn)地的枸杞放入烘箱中，于40℃下，干燥至恒重。

精確稱取約2 g枸杞放入研缽中，加入少量的蒸餾水，研磨成糊狀。倒入離心管中，用蒸餾水將研缽沖洗干凈，洗液合并到離心管中。于3 000 r/min離心3 min，棄去上清液(若上清液表面漂浮著枸杞籽，將種子取出重新研磨)。加入10 mL丙酮，于3 000 r/min離心3 min，將上清液倒入分液漏斗。殘渣中加入適量抗氧化劑(0.01%BHT)，于35℃下，以丙酮和石油醚(1∶2)混合試劑作為提取溶劑，對殘渣進行4次提取，每次提取15 min，提取至無色。合并提取液，倒入分液漏斗。加入少量的蒸餾水，洗去水溶性雜質，棄去水層。加入適量的無水硫酸鈉干燥。將有機層于38℃條件下進行旋轉真空濃縮至干［10］。全過程需避光操作［11］。

1.2.2 類胡蘿卜素的測定方法 將1.2.1處理好的樣品用石油醚溶解，定容至10 mL［12］，需避光操作。450 nm處測定吸光值。根據(jù)Beer-Lambert定律，每克枸杞樣品中類胡蘿卜素含量(mg/g)按式(1)計算［13］:

式中:

m——樣品中類胡蘿卜素含量，mg/g;

A——檢測到的枸杞樣品的吸光值;

V——樣品液體積，mL;

2 480——在1 cm光程長的比色杯中1 g/L枸杞樣品提取液的理論吸收值;

m1——枸杞樣品的質量，g。

1.2.3 主要類胡蘿卜素的HPLC測定方法

(1)標準溶液的配制:用電子天平準確稱取β-胡蘿卜素1 mg、玉米黃素1 mg和玉米黃素雙棕櫚酸酯2 mg，加少量二氯甲烷溶解，用流動相定容至10 mL，分別配成100，200 μg/mL的標準溶液，避光操作，－30℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)將1.2.1處理好的樣品用流動相溶解，定容至10 mL，避光操作，備用。

(3)色譜條件:柱溫:25℃;流動相:甲醇∶正己烷∶二氯甲烷∶乙腈=15∶20∶20∶40(體積比)，等度洗脫;檢測波長:450 nm;進樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min。保留時間定性。峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 不同產(chǎn)地的枸杞中類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素是枸杞中的重要活性成分之一，具有抗氧化的作用。由圖1可知，不同產(chǎn)地的枸杞中類胡蘿卜的含量差異很大，含量由高到低依次為:青海＞中寧＞固原＞內(nèi)蒙＞南梁＞新疆＞甘肅＞惠農(nóng)。青海枸杞的類胡蘿卜素含量最高，可達2.10 mg/g，惠農(nóng)枸杞的類胡蘿卜素含量最低，為0.41 mg/g，兩者之間差了5倍。由此可知，不同產(chǎn)地枸杞中類胡蘿卜素的含量差異顯著。類胡蘿卜素是枸杞的主要色素，其含量直接影響枸杞的顏色，從而間接影響枸杞的感官品質。

圖1 不同產(chǎn)地的枸杞中類胡蘿卜素含量Figure 1 The contents of carotenoids of Lycium barbarum L.in different areas

2.2 高效液相色譜法檢測枸杞中的主要類胡蘿卜素

2.2.1 標準曲線的建立 將玉米黃素標準品、β-胡蘿卜素標準溶液分別稀釋到 5，10，25，50，100 μg/mL。將玉米黃素雙棕櫚酸酯標準品稀釋到 20，50，80，100，200 μg/mL，重復測定3次。繪制標準曲線。根據(jù)信噪比S/N=3，測得3種類胡蘿卜素的檢出限，結果見表1。由表1可知，在相應的線性濃度范圍內(nèi)，R2均大于0.999 5，呈良好的線性關系，可以滿足定量分析的要求。3種類胡蘿卜素標準品及惠農(nóng)枸杞樣品的色譜圖見圖2、3。對比圖2和圖3，發(fā)現(xiàn)玉米黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素雙棕櫚酸酯的標準品和樣品的出峰時間一致，峰型良好，符合定量檢測的要求［6］。

表1 3種類胡蘿卜素標準品的標準方程、相關系數(shù)及檢出限Table 1 Standard curve of three kinds of carotenoids

圖2 標準品色譜圖Figure 2 Chromatogram of standards

圖3 惠農(nóng)枸杞樣品色譜圖Figure 3 Chromatogram of the Lycium barbarum L.in Huinong

2.2.2 方法準確性試驗 分別取3種標準品混合溶液，重復進樣6次。發(fā)現(xiàn)3種標準品的色譜峰保留時間波動不超過0.1 min。記錄3種標準品的峰面積，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的峰面積RSD分別為0.27%，0.21%，0.19%，表明試驗精密度良好。

取枸杞樣品，按1.2.1樣品處理方法對樣品進行前處理，分別于 0，2，4，6，8，12 h 進樣 10 μL，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的峰面積RSD分別為1.27%，1.96%，2.04%，表明枸杞樣品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

取同一種枸杞樣品3份，按1.2.1樣品處理方法對樣品進行平行前處理，分別進樣10 μL，按照外標法定量，計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的RSD分別為 1.33%，0.92%，1.17%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

精密稱取4份2 g左右的枸杞，第1份為空白，在另外3份中分別準確加入濃度分別為50，50，100 μg/mL的3種類胡蘿卜素標準品各1 mL，按照1.2.1方法將4份樣品進行處理，重復測定5次，測定標樣回收率。計算得玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的回收率分別為96.6%，90.8%，103.9%。本試驗的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率表現(xiàn)良好，說明本方法可以滿足不同產(chǎn)地枸杞干果中玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的定量要求。

2.2.3 不同產(chǎn)地枸杞中幾種主要類胡蘿卜素含量測定結果

不同產(chǎn)地的枸杞樣品按1.2.1方法進行處理，按1.2.3方法測定，平行測定3次，結果見表2。由表2可知，枸杞中3種類胡蘿卜素含量從高到低，依次是:玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞β-胡蘿卜素。其中，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量是枸杞中最主要的類胡蘿卜素，是類胡蘿卜素存在的主要形式，可以作為枸杞的特征類胡蘿卜素。其它類胡蘿卜素酯的含量較少，且類胡蘿卜素酯生理活性意義不大［14］，所以本試驗沒有進行研究。

不同產(chǎn)地的枸杞中β-胡蘿卜素含量最高的是青海產(chǎn)的，含量為18.61 μg/g，而枸杞是自然界中β-胡蘿卜素含量最高的物質之一，青海產(chǎn)的枸杞可以作為β-胡蘿卜的天然來源之一。不同產(chǎn)地枸杞中玉米黃素含量最高的也是青海產(chǎn)的枸杞，含量為179.81 μg/g。枸杞中，玉米黃素和β-胡蘿卜素可以合成玉米黃素雙棕櫚酸酯，而且具有重要的生理活性［15］，其含量是評價枸杞品質的一項重要指標。從這個角度來說，青海產(chǎn)的枸杞是最好的。

表2 不同產(chǎn)地枸杞類胡蘿卜素含量測定結果Table 2 The content of carotenoids in wolfberry of different origins 2

2.3 聚類分析

使用 SPSS 19.0軟件對不同產(chǎn)地的枸杞中β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯和類胡蘿卜素的含量進行了系統(tǒng)聚類分析，結果見圖4。聚類分析是將樣品按照品質特性相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程［16］。由圖4可知，中寧、固原、青海的枸杞的相似程度較高，新疆、甘肅、南梁、惠農(nóng)、內(nèi)蒙古的相似程度較高。所以，8個不同產(chǎn)地的枸杞干果樣品一共分為兩大類，其中中寧、固原、青海的枸杞樣品為第一大類，其余5個產(chǎn)地的枸杞為第二大類。

圖4 不同產(chǎn)地枸杞樣品聚類分析圖Figure 4 The clustering diagram of Lycium barbarum L.in different areas

3 結論

本試驗利用高效液相色譜法測枸杞中β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量，該方法快捷、簡便，可在20 min內(nèi)使枸杞樣品中的β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯完全分離，可以定性、定量分析枸杞中3種類胡蘿卜素。

通過研究了解不同產(chǎn)地枸杞中主要類胡蘿卜素的含量差異，這與不同產(chǎn)地的氣候條件有著密切的關系，但是環(huán)境因素只起著一定的影響作用。研究表明，遺傳因素的差異決定了不同產(chǎn)地的枸杞品質的差異性，其中，青海枸杞β-胡蘿卜素、玉米黃素、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量是8個產(chǎn)地中最高的。

聚類分析的結果顯示，中寧、固原、青海的枸杞聚為一大類，其他產(chǎn)地的枸杞聚為一類，說明中寧、固原、青海的枸杞中主要類胡蘿卜素含量相似性較大，而與其他產(chǎn)地枸杞比較差異相對較大，從而區(qū)分明顯。

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