富硒茶中硒蛋白凍融法輔助提取工藝優化

王 珺 董文賓 楊芙蓮 高二東 緱敬軒

(陜西科技大學，陜西西安 710021)

硒是氧族元素，具有金屬和非金屬特性［1］。硒可以增強自由基的清除能力，提高體內的抗氧化能力，此外硒還有提高免疫能力［2－4］、降血脂、抗腫瘤［5－7］、抗疲勞、解毒、防治心腦血管疾病、提高生殖機能、預防老年性疾病、預防多種地方性疾病等多重功效。茶葉中所含蛋白質的量為茶葉干重的15%～30%。胡秋輝等［8］的研究發現茶葉中的硒大部分都與蛋白質相結合，其蛋白硒的含量占有機硒含量的79.56% ～88.70%。目前中國對茶葉蛋白提取方法研究較多的為堿法提?。?］、酶法提?。?0］、鹽法提?。?1］、超聲輔助提?。?2］和反復凍融法輔助提?。?3］，硒蛋白多采用傳統堿法進行提取，提取液一般選用NaOH［14－16］。反復凍融法輔助提取是利用低溫冰箱把提取液于 －40 ℃冷凍1 h，然后加熱溶化，反復 3 次［17，18］，在凍融過程中實現細胞壁破碎的目的，使得硒蛋白更容易被提出。

本研究擬通過三凍三融技術輔助傳統堿提法提取硒蛋白，研究在輔助手段影響下液固比、提取溫度、提取液濃度、提取時間以及提取次數等因素對硒蛋白提取率的影響，進而使富硒茶茶渣中硒蛋白提取率大幅度升高，提高富硒茶利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富硒夏秋茶茶粉:陜西安康紫陽富硒綠茶有限責任公司;

乙醇:分析純，天津市富宇精細化工有限公司;

牛血清蛋白:分析純，上海勵瑞生物科技有限公司;

考馬斯亮藍G-250、磷酸、NaOH:分析純，天津市富宇精細化工有限公司;

HCl、K2SO4:分析純，北京化工廠;

H2SO4:分析純，成都市科龍化學試劑有限責任公司;

CuSO4:分析純，西安市科洛試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

移液槍:DV31142型，大龍醫療設備(上海)總部;

萬分之一電子天平:BT354S-XM型，北京賽爾斯精密儀器有限公司;

電熱鼓風干燥箱:101-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司;

精密增力電動攪拌器:JJ-1型，常州國華電器有限責任公司;

低速離心機:TM-7706型，上海湘儀科學儀器有限公司;

真空干燥箱:DZ-1BC型，北京博醫康實驗儀器有限公司;

精密pH計:PHS-3C型，北京賽爾斯精密儀器有限公司;

可見光分光光度計:UV-2800型，上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 硒蛋白含量測定 采用凱氏定氮法。按GB 5009.5—2010執行，蛋白質換算系數為6.32。

1.2.2 硒蛋白的提取 稱取5 g茶粉用75 mL 40%乙醇60℃水浴浸提15 min，離心(3 500 r/min，10 min)后去除上清液，重復2次，茶渣干燥至恒重。加一定濃度的NaOH溶液于茶渣中水浴攪拌浸提(200 r/min)，然后在－40℃條件下冷凍1 h，水浴加熱使其融化，反復3次后以3 600 r/min的轉速離心15 min取上清液，此上清液即為硒蛋白提取液，用1 mol/L的鹽酸調上清液pH值至等電點，靜置15 min后離心(8 000 r/min，15 min)，沉淀干燥至恒重即為硒蛋白粗品。用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)測定硒蛋白粗品中的蛋白質含量，以此來計算提取率。每組做3次平行試驗，取其平均值。

蛋白質提取率的計算公式見式(1):

1.2.3 硒蛋白等電點的確定 稱取去酚后的茶渣4.000 g，在液固比60∶1(V∶m)，NaOH濃度為0.1 mol/L，提取溫度為60℃的條件下提取2次，離心后合并提取液。取20 mL硒蛋白提取液分別裝入8支按順序編號試管中，依次用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調節使得提取液的pH值分別為 5.5，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，靜止 10 min用轉速為3 600 r/min的機器離心，以此測定上清液蛋白含量，殘留量最低即是硒蛋白質等電點。

1.2.4 硒蛋白提取工藝的優化 本試驗在三凍三融技術的輔助下，分別考察了液固比、提取液濃度、提取溫度、提取時間以及提取次數對硒蛋白提取率的影響。

(1)液固比的影響:分別稱取5 g經去酚后的茶渣，選取10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH，70℃下水浴攪拌提取3 h，考察液固比對硒蛋白提取率的影響。

(2)堿液濃度的影響:分別稱取5 g經去酚后的茶渣，以50∶1(V∶m)的液固比，將其分別溶解于濃度為0.05，0.10，0 .15，0.20，0.25，0.30 mol/L 的 NaOH 溶液中，在 70 ℃下水浴攪拌提取3 h，考察堿液濃度對硒蛋白提取率的影響。

(3)提取溫度的影響:分別稱取5 g經去酚后的茶渣，以液固比為50∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH在提取溫度分別為 30，40，50，60，70，80，90，100 ℃的條件下水浴攪拌提取3 h，考察提取溫度對硒蛋白提取率的影響。

(4)提取時間的影響:分別稱取5 g經去酚后的茶渣，以液固比為50∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH，70℃分別水浴攪拌提取 1，2，3，4，5，6，7，8 h，考察提取時間對硒蛋白提取率的影響。

(5)提取次數的影響:分別稱取5 g經去酚后的茶渣，以濃度為0.1 mol/L NaOH按液固比50∶1(V∶m)分別提取1，2，3，4次，溫度為70℃，每次提取時間為3 h。首次提取過后把第一次提取后余留殘渣用同方法再提取一次，以此類推，測定不同提取次數所得提取物中蛋白含量。考察提取次數對硒蛋白提取率的影響。

1.2.5 硒蛋白粗品的純化 準確稱取4.000 g硒蛋白粗品(硒蛋白粗品由本試驗研究所得的最優提取工藝提取)，加入40%乙醇溶液60 mL，在60℃下水浴1.5 h，以6 000 r/min的轉速離心10 min取其沉淀，60℃下烘至恒重后測定其純度。其中硒蛋白含量的測定用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)。每組做3次平行試驗，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 硒蛋白的標準曲線

由圖1可知，蛋白質含量在0～100 μg時呈線性良好，其線性方程為 y=0.007 0x+0.008 3，相關系數 R2=0.999 3。

2.2 硒蛋白等電點的確定

圖1 蛋白質標準曲線Figure 1 The standard curve of protein

圖2 硒蛋白等電點Figure 2 The isoelectric point of selenoproteins

由圖2可知，上清液中蛋白質殘留率在pH為3.5時最低，即在此pH值下硒蛋白膠體溶液最不穩定，蛋白質沉淀量最多，也最接近等電點。因此，選取pH=3.5為硒蛋白的等電點，用以沉淀硒蛋白。

2.3 硒蛋白提取工藝的優化

2.3.1 液固比對提取率的影響 由圖3可知，硒蛋白提取率隨液固比增加先增后減，在70∶1(V∶m)時提取率達到最大值40.81%。說明在液固比為70∶1(V∶m)時，硒蛋白在堿液中的溶解度已經飽和，而過量的堿液會破壞氨基酸的結構，然而在液固比50∶1，60∶1(V∶m)時，提取率分別為38.54%和38.61%。綜合考慮提取率和耗堿耗水等生產成本，最終確定液固比為50∶1(V∶m)。

圖3 液固比對提取率的影響Figure 3 Effect of liquid-solid on the extraction rate for selenoproteins

2.3.2 提取液濃度對提取率的影響 由圖4可知，硒蛋白質提取率隨NaOH濃度遞增而先增后減，在NaOH濃度在0.10 mol/L時，提取率最大達到35.58%。因為隨著NaOH濃度的增大，對蛋白質和氨基酸的破壞越大，最終導致提取率降低。而且NaOH濃度過高不僅降低硒蛋白的質量，還對提取設備和環境造成不利影響。因此，選取NaOH濃度0.10 mol/L最佳。

2.3.3 溫度對提取率的影響 由圖5可知，硒蛋白提取率隨溫度的增加而降低。在70℃時硒蛋白提取率最大達到41.69%。下降原因可能是溫度過高，導致蛋白質和細胞中其他物質結合，從而影響提取效果。而且溫度越高，對硒蛋白的結構破壞越大，還造成能耗過高，增加生產成本，所以，提取溫度確定為70℃。

圖4 堿液濃度對提取率的影響Figure 4 Effect of Alkali concentration on the extraction rate for selenoproteins

圖5 溫度對提取率的影響Figure 5 Effect of temperature on the extraction rate for selenoproteins

2.3.4 提取時間的影響 由圖6可知，硒蛋白的提取率隨著提取時間的增長而先增后減，在提取時間為3.5 h時，提取率最高達到45.05%。這可能是由于時間過長，堿液對蛋白質破壞越大，導致蛋白質損失變大，最終影響蛋白質的提取率。此外，時間過長能耗變大，生產成本增加，因此綜合考慮。確定提取時間為3.5 h，提取率可達45.05%。

圖6 提取時間對提取率的影響Figure 6 Effect of extracting time on the extraction rate for selenoproteins

2.3.5 提取次數對提取率的影響 由圖7可知，增加提取次數，提取率逐漸降低。綜合考慮提取率和能耗、設備折舊等因素，確定提取次數為2次。

圖7 提取次數對提取率的影響Figure 7 Effect of extraction Frequency on the extraction rate

2.3.6 正交優化試驗 根據單因素試驗結果，設計了以液固比、堿液濃度、提取時間和提取溫度的4因素3水平即L9(34)，進行正交試驗，以此正交試驗進一步優化硒蛋白提取的工藝參數。正交試驗因素水平見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

由表2和3可知，4個因素中液固比相對于提取時間有顯著差異，堿液濃度和提取溫度相對于提取時間都有極顯著差異。因此以上4個因素在硒蛋白提取過程中影響大小的先后順序為:堿液濃度、提取溫度、液固比、提取時間。由此得出最宜提取組合為 A3B2C1D2，即采用液固比為60∶1(V∶m)，NaOH溶液濃度為0.10 mol/L，在70℃的條件下提取2次，每次提取3 h。

2.3.7 驗證實驗 驗證實驗按照最佳組合A3B2C1D2進行，最終測得硒蛋白粗品的提取率為60.93%，與正交所得結果基本一致，證實了提取硒蛋白的最佳工藝條件為:NaOH溶液濃度0.10 mol/L，液固比60∶1(V∶m)，提取溫度70℃，提取次數2次，每次提取3 h。

2.4 粗蛋白純化

由表4可知，準確稱取4.000 g硒蛋白粗品(硒蛋白粗品為本試驗所得最優提取工藝提取)，經過乙醇沉淀進行初步純化，可得到純度為78.26%的蛋白質，純化過程中蛋白質的損失率為7.21%。

表2 試驗結果Table 2 Results of the experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal

因正交表的四列已被占滿，且C因子的均方較小，所以將C作為誤差項進行方差的分析以及F值的檢驗。

因素 偏差平方和自由度F值Fa+0.05Fa+0.01顯著臨界值 臨界值 性A 29.481 2 27.734 19.000 99.000*1.063 2 B 1 106.045 2 1 040.494 19.000 99.000 ＊＊D 130.771 2 123.021 19.000 99.000 ＊＊誤差(C)

表4 粗蛋白初步純化結果Table 4 Purification results of the crude protein %

3 結論

本試驗結果表明以反復凍融法輔助堿提法提取硒蛋白可有效提高其提取率，較高二東等［19］利用超聲輔助浸提硒蛋白的提取率增長了20%，可有效提高其經濟效益。利用反復凍融輔助手段使細胞壁破損，硒蛋白更易被提取出來，且提取過程中不加入其他試劑，相較酶提取法試劑更加單一。然而反復凍融輔助提取時間長、步驟繁雜，有待進一步研究。

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