方格星蟲蛋白酶解工藝優化

孫雪萍 楊家林 徐 艷 劉海娟 任 義

(1.廣西海洋研究所，廣西北海 536000;2.北海藝術設計職業學院環境藝術設計系，廣西 北海 536000)

方格星蟲(Sipunculus nudus)，俗稱沙蟲，屬于星蟲動物門，星蟲科，方格星蟲屬動物，在中國海域有廣闊的資源分布。據記載［1］，沙蟲性寒、味甘、咸，具有滋陰降火、清肺補虛、活血強身及補腎養顏等功能，可以治療骨蒸潮熱，陰虛盜汗、肺虛喘咳等多種病癥。近年來大量的研究［2#4］發現，天然來源的蛋白質經過酶促反應水解后，得到的小肽具有多種生理功能，如抗氧化、抗菌、降血壓、降血脂及免疫調節等作用。現代研究［5#7］亦表明方格星蟲含有豐富的蛋白質，多種氨基酸和微量元素，具有抗氧化、抗菌、抗輻射等多種生物活性。目前已有研究［8］表明，方格星蟲經過生物酶解后獲得的酶解產物含有蛋白質、多肽以及游離氨基酸等成分，并具有較強的抗氧化作用。本研究擬采用響應面分析法優化采集自北海北部灣海域的方格星蟲的蛋白酶解工藝，旨在為方格星蟲的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

方格星蟲:采自廣西北海的廣西海洋研究所海水養殖示范基地的沙蟲養殖大塘，干燥后粉碎，過80目篩備用，凱氏定氮法測定蛋白含量為(69.3±5.41)%;

三硝基苯磺酸(TNBS)，美國Sigma公司;

胃蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(9萬U/g)、堿性蛋白酶(55萬U/g)、復合蛋白酶(8萬U/g)、風味蛋白酶(3萬U/g)和中性蛋白酶(5萬U/g):諾維信生物技術有限公司;

胰蛋白酶:1萬U/g，廣西南寧東恒華道生物科技有限公司;

其余試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設備

電熱恒溫浴鍋:DK-S26型，上海精宏實驗設備有限公司;

紫外可見分光光度計:TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司;

精密電子天平:ME104型，梅特勒—托利多儀器有限公司;

精密pH計:PB-10型，賽多利斯科學儀器有限公司;

氮磷鈣測定儀:NPCa-02型，上海洪紀儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水解用酶的篩選 取1.5 g方格星蟲蛋白粉，加入30 mL水，按照表1中7種蛋白水解酶最適宜酶解條件進行酶解，酶與底物比設定為5%，攪拌酶解4 h后，沸水滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。

表1 7種蛋白水解酶最適宜的反應條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of seven proteases

1.2.2 水解度的測定 取水解上清液0.5 mL，加入 1%SDS 2.5 mL混合均勻。取混合液15 μL，依次加入1%SDS 35 μL，pH 8.2 磷酸緩沖溶液 1 000 μL，0.1% 三硝基苯磺酸(TNBS)500 μL。混勻后置于50℃烘箱中避光反應1 h后，加入0.1%HCl 2 mL終止反應，室溫靜置30 min后，340 nm下測定吸光值。以賴氨酸為對照品制作標準曲線。按照式(1)、(2)計算水解度(degree of hydrolysis，DH)［9］。

式中:

DH——水解度，%;

C1——水解后的游離氨基濃度，mmol/mL;

C0——水解前的游離氨基濃度，mmol/mL;

P——總肽鍵濃度，mmol/mL。

式中:

Ch——水解液蛋白濃度，g/mL;

htot——底物中肽鍵總數，由氨基酸分析結果得到方格星蟲為 9.6 mmol/g。

1.2.3 單因素考察 在確定水解用酶的基礎上，考察了酶與底物比(Enzyme/Substrate，E/S)，酶解時間和酶解溫度3個因素對方格星蟲蛋白酶解效果的影響。

(1)酶與底物比對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照不同的酶與底物比(4%，5%，6%，7%，8%)，50℃攪拌酶解4 h后，開水煮沸10 min滅酶，4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。

(2)酶解時間對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S為7%，50℃攪拌酶解不同時間(2，3，4，5，6 h)，滅酶，離心后測定水解度。

(3)酶解溫度對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S為7%，在不同酶解溫度下(40，45，50，55，60℃)攪拌酶解5 h后，滅酶，離心后測定水解度。

1.2.4 響應面分析試驗設計 在單因素試驗考察的基礎上，確定了E/S、酶解時間和酶解溫度3個因素的最適宜考察范圍。采用Design Expert 8.05軟件，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以E/S、酶解時間和酶解溫度為自變量，以水解度為響應值，設計三因素三水平響應面分析試驗。

1.2.5 統計分析 重復3次試驗，結果取其平均值。采用Design Expert 8.05軟件對數據進行響應面分析，包括顯著性差異分析、方差分析以及最佳試驗條件和最佳響應值預測。

2 結果與分析

2.1 水解用酶的篩選

由圖1可知，7種蛋白水解酶對方格星蟲蛋白水解效果相差較大。胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果較差。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶水解效果較好。復合蛋白酶的水解效果最佳，在相同的酶解條件下，水解度達到20.95%。因此選擇復合蛋白酶用于水解方格星蟲蛋白。

圖1 7種蛋白水解酶的水解效果Figure 1 The hydrolysis effects of seven different proteases

2.2 單因素考察

2.2.1 酶與底物比(E/S)對水解度的影響 由圖2可知，在一定范圍內，隨著E/S的升高，水解度隨之升高。但當E/S超過7%，水解度出現下降的趨勢，可能是由于酶濃度逐漸為底物所飽和的原因，因此選擇E/S為6% ～8%作為響應面考察的范圍。

2.2.2 酶解時間對水解度的影響 由圖3可知，在2～5 h時，隨著酶解時間的延長，方格星蟲蛋白的水解度相應地增加。當酶解時間超過5 h后，水解度有所下降。結果表明在5 h左右時蛋白基本水解達到平衡，因此選擇4～6 h作為考察范圍。

圖2 酶與底物比對水解度的影響Figure 2 Effects of E/S on DH

圖3 酶解時間對水解度的影響Figure 3 Effects of hydrolysis time on DH

2.2.3 酶解溫度對水解度的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度呈現先上升而后下降的變化趨勢。在40～50℃時，水解度隨著酶解溫度的升高而升高。當酶解溫度超過50℃，水解度有所下降。雖然酶解溫度的升高能夠提高酶解反應的速率，但是酶是一種具有催化活性的蛋白質，溫度過高會導致其部分失去催化活性，從而會減低酶促反應速率，因此選擇45～55℃作為考察范圍。

2.3 響應面試驗設計分析及結果

2.3.1 模型建立及顯著性差異分析 本研究在考察單因素的基礎上，采用響應面分析法對方格星蟲蛋白的最優酶解工藝進行優化。試驗因素及水平取值見表2。利用Design-expert軟件對表3的數據進行多元回歸擬合，得到對E/S、酶解時間和酶解溫度的二元多次回歸方程為:

圖4 酶解溫度對水解度的影響Figure 4 Effects of hydrolysis temperature on DH

表2 響應面分析因素及水平表Table 2 Factor and level of response surface experiment

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

由表4可知，模型二次項X1X2、X12和X32差異顯著。同時由P值可知，在E/S、酶解時間和酶解溫度3個因素中，酶解溫度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和E/S。同時由方差分析結果可以看出，回歸模型的P值為0.015 9，表明回歸模型顯著。失擬項的P值為0.976 2，表明失擬誤差相對于純誤差是不顯著的，該模型具有較好的回歸系數(R2=0.879 9)，說明該試驗設計是合理穩定的，能夠較好地描述試驗結果，使用回歸方程代替真實的試驗點進行方格星蟲蛋白酶解的分析和預測是可行的。

2.3.2 響應面直觀分析 由圖5可知，酶與底物比和酶解時間對水解度的影響不大，在兩個因素的全值變化范圍內，水解度隨酶與底物比的增加呈現先增加后降低的趨勢，隨著酶解時間的不斷延長，水解度趨于平穩。由圖6可知，酶解溫度的變化對水解度的影響高于E/S，在兩個因素的全值變化范圍內，水解度均呈現先增加后降低的趨勢，兩者的交互作用在圖形中反映出適宜的條件會使水解度到達最大值，但是過高或過低都會使水解度降低。由圖7可知，酶解時間和酶解溫度的相互作用呈現同樣的變化趨勢。

表4 響應面分析方差分析表Table 4 Variance analysis of response surface design

圖5 酶與底物比與酶解時間的等高線圖和響應面圖Figure 5 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and enzymatic hydrolysis time

圖6 酶與底物比與酶解溫度的等高線圖和響應面圖Figure 6 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and hydrolysis temperature

圖7 酶解時間與酶解溫度的等高線圖和響應面圖Figure 7 Contour diagram and response surface plot of effects of enzymatic hydrolysis time and hydrolysis temperature

綜合以上單因素及響應面分析試驗結果，使用Designexpert軟件，得到最佳的酶解條件為:E/S7.81%，酶解時間4 h，酶解溫度50.93℃，預期達到的水解度為23.76%。考慮實際生產情況，最佳酶解條件修正為酶與底物比7.8%，酶解時間4 h，酶解溫度50℃。按照確定的最佳酶解條件進行酶解驗證實驗(n=3)，所得的實際水解度為(24.81±1.72)%，說明所建立的試驗模型能夠真實反映三因素對于復合蛋白酶酶解方格星蟲蛋白的影響，該酶解工藝可靠穩定。

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應面分析法，考察了酶與底物比、酶解時間和酶解溫度3個因素對方格星蟲蛋白水解的影響，經過優化得到最佳酶解條件，采用復合蛋白酶酶解，酶與底物比為7.8%，酶解時間為4 h，酶解溫度為50℃。在此條件下，水解度達到24.81%，說明該工藝穩定可靠，對實際生產具有指導意義。大量研究［10#12］表明，生物活性肽是以非活性狀態存在于蛋白質中，通過適當的酶解作用，可以將潛在形式存在于蛋白質的活性肽釋放出來，從而得到具有特殊生物學功能的活性肽。因此本研究可為后續方格星蟲蛋白的開發和利用提供理論依據，同時方格星蟲蛋白酶解產物的生物活性有待于今后進一步的研究。

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