藍莓多酚提取方法及功能活性研究進展

伍 鶴 王遠亮 趙 琳 劉安然 陳綢薇

(湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128)

藍莓［1］果實為典型圓形多汁肉質漿果，因富含花色苷類物質而呈現為深藍色，常伴有一層果粉覆蓋在果皮表面，果肉清香爽口、酸甜均衡適度、口感極佳;種子極小，可食率達100%。單果平均重2 g左右，最大為5 g［2，3］。在長期的生產培育當中逐漸發展出以高叢、兔眼、半高叢、矮叢等代表的4個具有典型特征和優良性狀的人工栽種藍莓［4］。藍莓不僅含有適量的植物多糖、人體必須氨基酸、水溶性維生素和豐富的植物膳食纖維，以及維持細胞滲透壓的大量元素鉀、半微量元素鐵、微量元素鋅、錳等常規礦物營養素;花色苷類、單寧類、黃酮類等多酚物質含量也極為豐富［5］。表現為較強的抗氧化、抗炎、抗心血管疾病，抗腫瘤、抗突變能力［6］。

1 藍莓多酚的類型及結構

多酚物質是普遍存在于植物中，長期攝入能改善身體亞健康的狀態，是分子中包含有若干酚性羥基的多元酚類物質的總稱。藍莓多酚以花青素含量最為豐富，酚酸次之，黃酮類化合物的含量也相對較高;藍莓中以綠原酸(圖1)為代表，不同單體之間通過共價結合以及生化反應等方式形成基本的功能活性單元，分散存在于植物內［7，8］。黃酮類化合物的典型構架為C6—C3—C6，是一類苯環上具有羥基的二苯環化合物的總稱，同時具有兩個官能團的性質。藍莓中黃酮以花青素為主，除具有典型代表性的5類單體(圖1)之外，二氫黃酮(flavonol)、櫟精(quercetin)等含量也普遍高于一般功能性植物［9，10］。原花青素則是黃酮類化合物的單聚體或多聚體，并通過黃酮的代謝途徑最終轉化為花青素，是生物體內最有效的天然抗氧化劑［11］。

2 藍莓多酚的提取方法

對藍莓多酚需求的日益增加也在不斷促進著藍莓多酚提取技術的發展與進步。溶劑浸提法從最開始的水，到醇類、酮類、醚類，以及近年發展起來的簡單方便、高藥物活性保留、快捷、高特異性的物理機械、化學及生物模擬技術，不斷推動提取技術向著多酚物質分子結構的本質靠近［12］，使藍莓多酚的提取效率和質量達到一個新的高度。

2.1 溶劑浸提法

圖1 藍莓多酚的分子結構Figure 1 The molecular structure of blueberry polyphenols

溶劑浸提法是藍莓多酚提取中出現最早、最常見，也是最經典的方法。一般以酸性甲醇、乙醇或丙酮等常見溶劑為萃取劑，在特定條件下反復萃取;這種方法因簡便、低成本，因而應用較為普遍［13］。采用不同比例甲醇、丙酮、乙醇試劑和水的混合試劑于加熱條件下浸提藍莓干果中的多酚混合物，發現用50%的乙醇多酚萃取率最高，得率為10.65 mg/g·干果［14］。安曉婷等［15］采用60%的乙醇溶解藍莓渣，發現當藍莓渣濃度為50 g/L時，浸提2 h，未萃取藍莓多酚僅為2.9%;以甲醇的酸性溶液(pH=3)作為萃取劑，可以在相對比較溫和的條件下(40℃)，通過較短的時間(40 min)，獲得藍莓黃酮提取物2.57 mg/g［16］。Nicoue 等［17］比較了相同條件、相同濃度下不同有機酸和無機酸對藍莓花色苷提取效果的差異，結果顯示10%磷酸處理的乙醇對藍莓花色苷提取效率最高、活性保存最好。表明醇類物質對藍莓花色苷的提取效率和質量要優于其他溶劑，并以乙醇最佳。現已證實在花色苷的提取工藝中，影響花色苷提取率的因素依次為醇濃度＞溫度＞時間 ＞料液比［18］。

溶劑萃取法因操作簡便、設備簡單、成本低廉、易于實現大規模生產而成為目前主流的萃取方法，但普遍存在試劑耗量大、提取耗時長、提取效率低等缺點，且易受溶劑中本底雜質干擾;在低濃度二氧化硫的水溶液中添加適量的檸檬酸可以提高藍莓中花青素的萃取率，但是Fe2+、Fe3+以及重金屬離子Pb2+等會干擾其穩定性［19］，不利于花青素的提取;因而此方法在對樣品純度、活性要求高的醫藥、精密分析等領域的應用受到限制。

2.2 超聲波輔助提取

藍莓多酚物質主要存在于植物細胞原生質體及液泡內，植物細胞中起支撐和保護作用的細胞壁因為具有較高的機械強度，阻礙多酚物質從細胞內向外擴散。超聲波具有良好的方向性和較強的穿透能力，并且其獨特的空化作用能使液體分子間發生劇烈的碰撞和交互作用，起到類似于攪拌和加熱的作用;使植物細胞壁在短時間內破裂，釋放出內容物，加速酚類分子自由運動和擴散，達到快速萃取的效果。同時超聲波輔助提取儀器設備廉價易得，操作簡便易行、能較好地保護提取多酚類成分的物理結構和生理活性。

超聲輔助條件下，采用約52%的乙醇，在37 min內，分2次提取藍莓凍果，確定冰凍藍莓中花青素為3.36 mg/g［20］。張玉香等［21］采用類似方法優化藍莓葉中黃酮的提取，提取量為 4.23%，和程安瑋等［22］的結論相符合(3.79% ～ 5.26%);超聲波提取1 h后，可使藍莓凍果中的總酚萃取量約達到20.5 mg/g［23］。超聲波輔助萃取不僅具有普通溶劑萃取法設備、操作相對簡單的優點，還能節省試劑、節約時間、提高萃取率，是一種安全環保的方法。但超聲波和聲波一樣具有衰減的特性，作用直徑過大時，會形成盲區，無法保證輸出功率，影響萃取速度和效果，從而難以實現單次大量生產，限制了其工業化應用。

2.3 酶解提取法

高選擇性、高效率、特異性是生物酶解提取法的三大特點，選取合適的生物酶，破壞并降解細胞壁中的纖維素和果膠，從而使植物細胞的原生質體、液泡失去細胞壁的保護而吸水脹裂，釋放出多酚、花青素等活性物質，達到提取的目的［12］。其處理條件溫和，營養素損失小，因而在活性成分的保護上較之于其他方法具有獨到的優勢［24］。纖維素和果膠均為藍莓果實細胞細胞壁的組成成分，采用纖維素酶和果膠酶對藍莓花青素進行酶解輔助萃取;結果表明，前者比后者更適合于藍莓細胞細胞壁的分解，酶解更徹底，提取率達97%以上，提取量為3.50 mg/g·鮮藍莓果［25］。采用不同類型的纖維素酶和果膠酶的混合酶解液對藍莓果漿處理1 h后，可使藍莓中果汁中的花青素提取率從6.49%提高到14.1%，多酚提取量從0.89 mg/g提高到 1.75 mg/g，分別提高了約 2 倍［26］。

生物酶所具有的高度專一性、高效性和易變性等特點決定了酶解法的效果與使用的酶的種類、酶解時間、酶解pH、酶解溫度息息相關。總的來說，選擇對纖維素分解能力、細胞壁破壞強的生物酶，并在其最佳pH和最適溫度下酶解，防止因時間過長造成的分解，能將藍莓中多酚類物質的提取量最大化，但缺點是成本過高。

2.4 微波輔助提取

微波輔助提取借助于微波的熱特性、波動性、高頻性等特點，穿透到植物細胞內部，引起細胞內分子的高頻電磁振蕩;利用不同物質在細胞中不同的微波吸收能力，針對性使被分離物料受熱，達到選擇性提取分離的目標。在微波作用下，細胞內有效成分在較低溫度下快速向溶劑中分離、擴散;在保證提取物生物活性的同時，極大地提高了效率。Ganzler于1986年首次成功采用微波輔助法提取出具有生理活性的植物天然產物，之后幾十年，微波輔助提取技術在食品分析、生物技術方面已取得長足的發展和進步［27］。劉小莉等［28］比較了微波輔助萃取和傳統溶劑浸提法對藍莓葉黃酮量的提取差異，結果顯示微波功率500 W下萃取50 s，可比在同等條件下有機溶劑乙醇萃取的黃酮含量高1.25倍，達30.18 mg/g·藍莓葉。薄艷秋［29］發現微波萃取不但節省了大量時間，也明顯提高了藍莓花色苷的萃取量;許相雯［30］也得到了類似的結論，并確定了最佳提取工藝為萃取溫度30～70℃，乙醇濃度40% ～80%，固液比1∶10～1∶50(m∶V)。微波輔助萃取法兼具上述幾種方法的優點，在大幅縮短萃取時間的同時，有效地保護了藍莓多酚的分子結構和生理活性，具有較高的應用價值。但設備成本和使用費用偏高，故大模應用受到限制，在提高萃取率的同時進一步降低成本將是下一步研究的重點之一。

3 藍莓多酚的功能活性

因多酚類物質易與腸道內的消化酶結合影響蛋白質的吸收，過去人們一直把多酚類物質視為抗營養因子。但隨著研究的深入，許多資料都顯示藍莓等漿果富含的多酚類物質具有強抗氧化、預防心血管疾病、抗癌、抑菌消炎、抗病毒、防止腦神經老化、抑制膽固醇上升等保健作用［31］;能夠通過調劑人體各個臟器的內分泌和機體代謝，有效地預防疾病的發生，并且比普通藥物的安全性更好［32］。

3.1 抗氧化能力活性

自由基作為一種能量傳遞的中間產物，參與人體內各項生理生化反應，其含量的動態平衡對維持人體內環境的穩定和健康具有重要意義。受外部環境因素刺激或年齡增加時，細胞內自由基累積速度大于清除速度，產生氧化應激［33］;表現為細胞、組織、器官癌變、功能喪失，染色體變異，甚至是死亡。藍莓多酚可以通過提供大量電子受體的方式來阻斷自由基的鏈式反應，從而達到消除機體內過剩自由基的目的，并能與Vc、VE產生協同效應。藍莓多酚對ABTS+·和 DPPH自由基清除一半時的濃度分別為12，45 mg/mL，抑制乙烯生成時(EC50)每克藍莓多酚提取物相當于100 μmol Vc［34］;藍莓中多酚的含量與抗氧化能力成正比，并具有顯著相關性(相關系數 r=0.97)［35］。Joseph 等［36，37］發現，富含多酚的藍莓提取物可顯著減少細胞內鈣質的流失和蛋白激酶的表達活性，從而達到保護細胞的目的。于飼料中添加2%藍莓多酚，連續飼養大鼠12周，可刺激大鼠腦細胞分泌產生腦源性神經因子(BDNF)和活性蛋白質(REB)，顯著改善大鼠的記憶能力和行為表現［38］。

3.2 預防心血管疾病活性

藍莓多酚類物質作為一種高活性抗氧化劑，能顯著降低血液中血脂、膽固醇以及低密度脂蛋白的含量，提高體內抗氧化酶的水平;清除體內過量游離態自由基、降低氧化應激風險，加強自身免疫系統預防能力，減少相關疾病的患病率［39］。富含多酚的藍莓提取物能顯著降低大鼠脂質過氧化產物，提高其腦抗壞血酸水平和谷胱甘肽水平［40］。同樣能顯著抑制脂多糖(LPS)的生成與釋放，減緩BV2細胞內一氧化氮合酶和環氧化酶相關啟動子的活性，減弱NF-κB誘導的核位移的作用［41］;前列腺素和人體的炎癥息息相關，藍莓多酚可抑制正常細胞內過量前列腺素的生成，能較好地抑制細胞內過量脂多糖造成的負面影響［42］。高血脂模型大鼠在攝入不同劑量藍莓花色苷后，其體內三大抗氧化物酶(SOD、GHS-PX、T-AOC)的活性得到了顯著提高，細胞毒性物質丙二醛(MDA)的含量顯著減少，并表現出了一定的劑量依賴關系［43］，顯現出藍莓多酚的強抗應激突變功用。

3.3 抗癌活性

癌癥是細胞基因水平調控失效、異常增殖、機體正常生理調節失效的結果。藍莓多酚能有效阻斷致突變劑亞硝酸鹽在人體內的合成，減弱外源性致癌物質的誘變作用;抑制癌細胞染色體復制，修復受損DNA，防止DNA鏈斷裂，并殺傷、抑制癌細胞的生長;提高人體抗癌能力，體現出優秀的抗誘變作用。Bornsek等［44］以人結腸癌細胞(Caco-2)、肝癌細胞(HepG2)、血管內皮細胞(EA.hy926)、大鼠血管平滑肌細胞(A7r5)為試樣，研究發現藍莓多酚在極低濃度下仍然能很好地抑制腫瘤細胞的增生和分化。同時，藍莓中豐富的多酚物質可抑制肝臟細胞受纖維化因素所導致的非正常分裂和增生，干擾其分泌胞外基質，可降低試驗模型大鼠肝纖維化風險和患肝癌的幾率，并適用于有機有毒化合物CCl［45，46］;4對于致突變劑甲磺酸和高活性間接致癌物苯并芘所致的基因、染色體突變也有一定的抑制和保護作用［47］;藍莓中的槲皮素也能防止過氧化氫對人類淋巴細胞DNA的過氧化作用及苯并芘的破壞［48］。骨髓的造血功能與造血干細胞的分化密不可分，藍莓多酚類物質能與胡蘿卜素、番茄紅素、香豆素等植物化學物質相互促進，加強造血干細胞的生理活性、分化功能，對血液疾病的預防和治療具有積極意義［49］。

3.4 抑菌、抑病毒活性

一定濃度的藍莓多酚，不僅對動植物正常細胞無毒害作用，更能顯著抑制多種細菌、酵母和真菌的生長和繁殖［50］，而且還能顯著降低病原微生物對動物腸道上皮組織的粘附性。近年來研究［33］表明藍莓多酚通過抑制艾滋病毒基因的復制、轉錄來延緩艾滋病的發病期，對輪狀病毒感染所致的腸胃炎和部分RNA病毒也能起到一定的殺滅作用。藍莓多酚中高含量的酚酸對于金黃色葡萄球菌也有較強抑制能力，但如果藍莓中還原糖含量過高則會削弱抑制效果，表現為負相關［51］。同時，藍莓多酚具有對抗生素抗藥性微生物的廣譜抑制作用，可以減少特定種類抗生素的使用量，增加病原性細菌對抗生素的敏感程度，提高抗生素的療效［52］。Anthony等［53］認為，藍莓多酚通過抑制原生動物滋養體(trophozoite)的生長，達到抑制原生動物繁殖的目的，在隱形孢子蟲病等的預防中起到一定作用。Shen等［54］比較了不同品種藍莓多酚對李斯特菌和腸炎沙門氏菌的抑制能力，發現其最低殺菌濃度分別為450，600 mg/mL。表明藍莓多酚對常見的食源性致病菌有較強的抑制、殺滅能力，說明多酚類物質不僅在保健、改善亞健康方面具有積極意義，同時在食品的貯藏、保鮮方面也有潛在應用價值。

3.5 其他作用

因藍莓多酚在200～300 nm波長之間對紫外光有較強的吸收能力［55］，因此可以作為防曬劑使用，用以阻止皮膚黑色素的生成。Andress-Lacueva等［56］以成年大鼠為對象，建立老年癡呆模型，每天灌胃3.2 mg/kg劑量的花色苷，發現30 d后大鼠因老年癡呆出現的短期記憶失常有較大改善，表明藍莓多酚類物質能在一定程度上改善由年齡增加所引起的大腦激素調節失常。另外，藍莓中所含多酚類物質能促進眼中傳導光刺激給大腦的視紅素的產生和再合成，從而達到增強人視力的功效［57］。

4 展望

藍莓多酚的提取和功能活性研究等方面已經取得一些進展和成果，建立了較為成熟的提取方法，驗證了其在體內外的各種生理活性功能，但整體而言，對藍莓多酚的利用尚處于初級階段。比如多酚的提取絕大多數還是停留在傳統粗放的有機溶劑浸提法，雖然成本低廉，但是提取物的質量和純度往往達不到要求，應用受到限制;雖在超聲波、酶提取法的發展方面取得了一些成果，但也僅限于花色苷、黃酮等單一或某一類多酚物質，對于總酚的提取效果有限;同時過高的初始投入和技術難度成為限制其工業化應用的主要制約因素。有效提取當前萃取技術尚不能萃取出的藍莓多酚也是以后發展的方向之一。藍莓多酚具有高效的生物活性已經得到公認，但是多酚在體內的作用機制、代謝過程以及與其他營養素之間的有無拮抗關系;花青素在體內的吸收率過低，怎樣提高多酚物質在體內的吸收利用率，從而達到高生物藥效等都是需要進一步研究的問題。

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