紅花黃色素聯合依達拉奉對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

摘要：目的 研究紅花黃色素（safflor yellow， SY）聯合依達拉奉（Edaravone， Eda）對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的保護作用及機制。方法 采用大鼠在體心肌I/R損傷模型，30只雄性SD大鼠按照隨機數字表隨機分為5組（每組6只）：假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、SY90mg/kg組（SY組）、Eda10mg/kg組（Eda組），SY90mg/kg聯合Eda10mg/kg組（SY+Eda組）。比色法測血漿超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），我院生化室測肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，TUNEL染色分析細胞凋亡。結果 與I/R組相比，SY組、Eda組血漿SOD活性升高，MDA、CK-MB含量及心肌細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P<0.05）；SY+Eda組與SY組、Eda組相比較，血漿SOD活性升高，MDA、CK-MB含量及心肌細胞凋亡減降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 在缺血性心肌損傷中，氧自由基過量生成，心肌細胞大量凋亡，SY、Eda可清除過量生成的氧自由基，降低心肌細胞的凋亡，提示其保護作用與其清除過量生成氧自由基有關，SY及Eda聯合用藥可加強對MIRI的保護作用。

關鍵詞：紅花黃色素；依達拉奉；氧自由基；心肌缺血再灌注

心肌缺血性疾病嚴重危害人類的生命健康，通過介入或藥物溶栓等方法使冠脈再通，是保護缺血心肌的關鍵，但是由此也可導致心肌缺血再灌注損傷（MIRI），這嚴重影響了其在臨床上的應用效果。尋找高效、低毒的治療MIRI的藥物，制定合理的治療方案，成為迫切需要解決的問題。本研究旨在探討紅花黃色素（safflor yellow， SY）聯合依達拉奉（Edaravone， Eda）對MIRI的保護作用及機制，為臨床合理用藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器 SY（山西華輝凱德制藥有限公司提供）；Eda（南京先聲制藥有限公司提供）；SOD、MDA及TUNEL試劑盒均購自于南京建成生物科技有限公司；BL-420s生物機能系統、小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；Bio-Tek酶標儀（美國）；LEICA DMIL倒置顯微鏡（德國）。

1.2動物與分組 健康成年雄性SD大鼠（由徐州醫學院實驗動物中心提供）30只，體重250300g，隨機分為5組（每組6只）：假手術組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（I/R組）、SY90mg/kg組（SY組）、Eda10mg/kg組（Eda組），SY90mg/kg聯合Eda10mg/kg組（SY+Eda組）。所有試驗均經徐州醫學院實驗動物福利和應用委員會批準，并遵守國際衛生協會《實驗動物福利和應用指南》。

1.3心臟I/R模型的制備和實驗方案 大鼠10%水合氯醛（3.5ml/100g）腹腔注射麻醉后仰臥固定，針式電極固定于大鼠四肢皮下監測肢體Ⅱ導聯心電圖變化，腹腔注射肝素鈉（500U/kg）抗凝。行氣管切開，氣管插管，小動物呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率75次/min，潮氣量68ml，呼吸比1：2）。暴露心臟，左心耳根部下方2mm處與肺動脈圓錐間穿線，采用套管法，通過牽拉結扎線結扎冠脈，以心電圖Ⅱ導聯ST段明顯抬高，心肌顏色變暗為結扎成功的標志，松開動脈夾進行再灌注[1]。Sham組只穿縫線，不結扎。模型組及藥物干預各組均進行30min缺血和120min再灌注。再灌注前1min，I/R組、SY組、Eda組、SY+Eda組分別經右側股靜脈輸注生理鹽水、SY90mg/kg、Eda10mg/kg、SY90mg/kg和Eda10mg/kg，SY及Eda均用等量生理鹽水稀釋。Sham組在對應時間點股靜脈輸注等量生理鹽水。

1.4觀察指標

1.4.1測血漿SOD、MDA、CK-MB含量 每組取6只大鼠，缺血再灌注末經右心室直接穿刺采血，2500r/min離心10min，提取血漿放入-80℃冰箱中，待標本收集完畢后，按試劑盒說明采用比色法測定SOD、MDA，于我院生化檢驗室自動生化儀測定血漿CK-MB活性。

1.4.2組織病理學觀察 每組取6只大鼠，缺血再灌注末迅速剪取左心室前壁缺血區心肌組織浸入10%的甲醛溶液中固定2448h，自動脫水機脫水，石蠟包埋、切片。按TUNEL試劑盒說明進行染色，凋亡的細胞核被染成棕褐色，未凋亡的細胞核為深藍色。高倍鏡（×400倍）下每張切片隨機選取10個互不重疊視野計算凋亡率：凋亡率/%=（視野內凋亡細胞個數/視野內所有細胞個數）×100%。

1.4.3統計學處理 應用SSPS13.0統計軟件，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示。統計分析采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），實驗組之間兩兩比較采用S-N-K法，方差不齊時采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1生化指標SOD、MDA和CK-MB變化 與Sham組相比，I/R組及藥物干預各組MDA、CK-MB含量增高，SOD活性降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與I/R組相比，SY組、Eda組、SY+Eda組MDA、CK-MB含量降低，SOD活性升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與SY組、Eda組相比，SY+Eda組MDA、CK-MB含量降低，SOD活性升高，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2心肌細胞凋亡率 與Sham組相比，I/R組及藥物干預各組心肌細胞凋亡率增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與I/R組相比，SY組、Eda組、SY+Eda組心肌細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與SY組、Eda組相比，SY+Eda組心肌細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3討論

心肌缺血后再獲取血液供應，常會出現細胞代謝功能障礙及結構破壞反而加重的現象[2]，其涉及的機制包括氧自由基（oxygen free radical， OFR）的過量產生、細胞內鈣離子超載、多種炎癥介質釋放、能量代謝障礙及細胞凋亡等[3]，其中OFR的過量產生是誘導MIRI的重要因素之一[4]。OFR產生過多以及抗氧化酶類活性下降，會引發鏈式脂質過氧化反應，損傷心肌細胞膜、細胞器乃至細胞核酸，導致細胞凋亡和壞死[5]。

研究表明，SY具有抗氧化、改善心肌組織能量代謝、降低細胞內鈣離子、減輕細胞凋亡等多種作用，表明SY有對抗MIRI的作用[6，7]。Eda作為特異的OFR清除劑，不僅可以抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑，而且對羥自由基（OH）亦有清除作用[8]。

SOD是超氧陰離子（O2-）的清除劑，可直接反映機體清除OFR能力。MDA作為OFR攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸引發脂質發生過氧化作用的標志產物，可間接反映機體受OFR攻擊的嚴重程度[9]。

實驗結果顯示，大鼠發生MIRI后，OFR過量產生，機體清除OFR能力下降，心肌細胞凋亡增多。給予大鼠SY、Eda靜脈注射后，血漿氧化指標改善，CK-MB活性降低，心肌細胞凋亡減少，且SY聯合Eda用藥時，增強了OFR清除能力及心肌保護作用，這為指導臨床聯合用藥提供了依據。

參考文獻：

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[9] Nakamura T， et al. Edaravone attenuates brain edema and neurologic deficits in a rat model of acute intracerebral hemorrhage[J].Stroke， 2008， 39（2）： 463-469.編輯/馮焱