液態發酵制備菜籽粕多肽的動力學研究

何榮海 邢 歡 劉 磊 王治平 馬海樂

液態發酵制備菜籽粕多肽的動力學研究

何榮海 邢 歡 劉 磊 王治平 馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院；江蘇省農產品物理加工重點實驗室江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心，鎮江 212013）

研究了枯草芽孢桿菌液態分批發酵菜籽粕的代謝特征，在分批發酵過程中細胞生長曲線呈S形，蛋白消耗曲線則呈反S形變化，多肽濃度在穩定期32 h達到最高10.2 mg／mL。通過SPSS擬合Logistic方較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態發酵過程中菌體生長規律，擬合Luedeking-Piret方程1.068ln（0.99 ＋ 0.01e0.226t）描述了多肽生成的規律，S ＝ 14.430-＋ 0.566ln（0.99 ＋ 0.01e0.266t）描述了底物蛋白消耗的規律，模型驗證中計算值與實測值的相對誤差絕大部分低于10%，較好反映了枯草芽孢桿菌分批發酵過程的動力學特征。

枯草芽孢桿菌 動力學模型 液態發酵 菜籽粕

菜籽粕是菜籽榨油后剩下富含優質蛋白的大宗副產品，但由于在菜籽熱榨或溶劑提取制油的過程中，菜籽蛋白嚴重變性，制約了對菜籽粕的深度利用，目前一般僅用作飼料或肥料，造成蛋白資源的浪費［1-2］。研究表明，以菜籽粕為底物，通過微生物發酵產生的蛋白酶水解菜籽粕中的蛋白質，并降解菜籽粕中的抗營養因子，可提高變性菜籽蛋白的生物利用度，制得具有良好功能特性且粗蛋白含量高的菜籽多肽［3-7］，是一種極具前景的菜籽粕深加工技術。枯草芽孢桿菌被廣泛應用于醫藥、農業和科學研究［8］，利用枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕的研究報道不多，而有關枯草芽孢桿菌液態發酵生產多肽過程的生長特性、發酵動力學分析及模型研究文獻報道更少，這方面研究的不足阻礙了發酵菜籽粕制備多肽的技術應用。

微生物反應動力學包括細胞生長動力學、代謝產物合成動力學和基質消耗動力學。通過發酵動力學的研究和發酵模型的建立，能夠深入了解發酵過程中菌體生長和產物形成的機制。對實現試驗數據的模擬放大、發酵條件優化與發酵過程自動化控制，提高產物發酵指標具有重要意義［9-11］。

本研究以實驗室保存的枯草芽孢桿菌為試驗菌株，進行菌株液態發酵條件優化研究，在此基礎上進行了該菌的生長規律、多肽生成及基質蛋白消耗等動力學研究，建立了描述發酵過程變化的動力學曲線。通過動力學曲線了解枯草芽孢桿菌發酵過程的代謝變化，獲得其動力學數學模型和模型參數，為進一步放大試驗，優化和工業化生產的優化與控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

枯草芽孢桿菌W1-3（Bacillus subtilis），本實驗室從鎮江恒順醋業股份有限公司提供的醋醅分離所得，北京諾賽基因公司鑒定；菜籽粕：江蘇省丹陽市正大油脂有限公司，粗蛋白質量分數33.14%；Gly-Gly-Tyr-Arg：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器及設備

BS124S型電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；YX280A型滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；PHS-25型數顯pH計：上海精密科學儀器有限公司；UV-1601型紫外可見分光光度計：北京諾利分析儀器公司；LRH-250型生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16型高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；QYC-200型全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 培養基

基礎培養基：含1.0 g／100 mL 葡萄糖、1.0 g／100 mL酵母粉、0.5 g／100 mL 氯化鈉和2 g／100 mL 瓊脂，pH 7.0。

種子培養基：含1.0 g／100 mL 葡萄糖、1.0 g／100 mL 酵母粉、0.5 g／100 mL 氯化鈉，pH 7.0。

發酵培養基：含5.0 g／75 mL菜籽粕，pH 7.0。

1.4 培養條件

將試驗用菌種接到基礎培養基，于30℃條件下恒溫靜止培養24 h，使菌種轉接活化。挑取3環活化后的枯草芽孢桿菌接入裝有100 mL種子培養基的三角瓶中，棉塞封口，置于空氣搖床中進行擴大培養，溫度30 ℃，轉速180 r／min，培養24 h，得到試驗用種子液。由培養好的菌懸液（菌體濃度為1×108個／mL），每瓶接種量為每瓶1.5 mL，培養基裝量75 mL／250 mL 三角瓶，36 ℃，180 r／min 搖床培養。

1.5 發酵液處理

將發酵產物取出，5 000 r／min條件下離心20 min，將上清液過濾后定容到同一體積（100 mL），保存備用。

1.6 分析測定

1.6.1 枯草芽孢桿菌數量的測定［12］

采用血球板計數法測定。

1.6.2 多肽含量的測定［13］

取2 mL樣品溶液，加入2 mL 10%的三氯乙酸（TCA）水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，然后在10 000 r／min下離心10 min，將上清液全部轉移到50 mL容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。取6 mL上述溶液置于試管中，加入雙縮脲試劑4 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r／min 離心10 min，取上清液于540 nm下測定OD值，與標準曲線（y＝0.152x＋0.052，R2＝0.999）對照計算得出樣品溶液中的多肽濃度。

1.6.3 游離氨基酸總量的測定［14］

吸取發酵處理液10 mL 2份，分別置于250 mL的錐形瓶中，加50 mL水，其中1份加入3滴中性紅指示劑（0.1%中性紅的50%乙醇溶液），用0.1 moL／L NaOH標準溶液滴定至指示劑由紅色變成琥珀色（pH＝7.4）即為終點，記錄消耗NaOH標準溶液體積V1。另1份加入20.0 mL 40%中性甲醛溶液和3滴百里酚酞指示劑（0.1%百里酚酞乙醇溶液），搖勻，靜置1 min，用NaOH標準溶液滴定至指示劑變為淡藍色（pH＝10.0）即為終點，記錄消耗NaOH標準溶液體積V2。

氨基酸態氮濃度（mg／mL）＝c×（V2-V1）×0.014×100

式中：c為NaOH 標準溶液的濃度／mol／L；V1為中性紅為指示劑消耗NaOH標準溶液的體積／mL；V2為百里酚酞為指示劑消耗NaOH標準溶液的體積／mL；0.014 為氮的毫摩爾質量／g／mmoL；100 為氨基酸態氮濃度轉換系數。

1.6.4 底物剩余蛋白含量的計算

菜籽粕中的蛋白消耗用于菌株生長和維持、多肽生成和游離氨基酸生成，菌株生長而分泌的蛋白酶作用與蛋白質而生成多肽和游離氨基酸，因此菌株生長和維持所消耗的蛋白絕大部分轉變成了多肽和游離氨基酸，故蛋白含量可用菜籽粕中總蛋白量減去多肽和游離氨基酸的含量。

式中：M總為菜籽粕中總蛋白含量／mg；M1為多肽含量／mg；M2為游離氨基酸含量／mg。

2 結果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌發酵過程代謝變化特征

在分批發酵中，枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕代謝過程變化如圖1所示。

圖1 枯草芽孢桿菌分批發酵過程曲線

從圖1中可見，該菌生長延遲期較短，發酵0～8 h，菌量增加不明顯，多肽基本不生成，蛋白消耗相對較少。8～28 h為生長對數期，菌體數明顯上升，多肽產量隨著菌體數上升而迅速增加，蛋白消耗明顯上升，蛋白量下降到640 mg。28～36 h為平穩期，發酵液中蛋白量變化不明顯，菌量也幾乎不變，后期會下降，但多肽的濃度還繼續上升，32 h達到最高10.2 mg／mL。整個發酵過程從菌體的緩慢生長到達最高的菌體數9.845×109個／mL，多肽濃度從基本不生成到達最高的10.2 mg／mL（多肽得率高達20%），基質蛋白從基本不變到最后基本耗完，整個發酵過程菌體生長代謝正常，多肽濃度達到優化預測值，整個發酵過程沒有異常，試驗很成功，為以后動力學模型的參數估算提供保障。

總體分析，枯草芽孢桿菌細胞生長曲線為S形，蛋白消耗曲線則呈反S形變化，且多肽為菌體次級代謝產物，8～28 h多肽量隨細菌量的增加而增加，而多肽濃度的最高峰卻在穩定期中出現，因此多肽的生成屬于生長部分偶聯型［15］。

2.2 菌體生長動力學

Logistic模型認為微生物生長速率不依賴物質限制［16］。這種動力學的限制因子是細胞濃度或生長時間。Logistic模型是一個典型的S型曲線，能較好地反映分批發酵過程中因菌體濃度的增加對自身生長存在的抑制作用，并能較好地擬合分批發酵過程中的菌體生長規律。因此，本研究采用該模型描述菌體細胞的生長，即

式中：X 為菌體數／109個／mL；μm為最大比生長速率／109個／h；Xmax為菌體數最大值／109個／mL。

以方程（2）為自定義函數，用SPSS軟件進行非線性擬合，擬合結果如圖2所示。

圖2 枯草芽孢桿菌生長試驗值與模型方程擬合曲線

式中：X0＝0.098；Xmax＝9.845；μm＝0.226；R2＝0.984。從圖2可發現，方程（3）的計算值與試驗數據能較好地吻合。因此該方程較好的描述了枯草芽孢桿菌正常液態發酵過程中菌體生長規律，為優化控制提供了參考。

2.3 多肽生成動力學

產物主要指的是細胞培養過程中代謝生成的細胞量以外的產物。按照產物生成與菌體生長的關系，可以分為3類。產物形成與菌體生長偶聯型：只是在菌體生長階段才有產物產生；產物形成與菌體生長部分偶聯型：在菌體生長階段有部分產物形成，而部分或大部分產物是在菌體處于生長穩定期形成的；產物形成與菌體生長非偶聯型：只要細胞存在產物就會生成。Luedeking-Piret方程是由Luedeking和Piret提出的用來描述產物形成與細胞生長關系的模型［17］：

當α≠0，β＝0時，產物形成為生長偶聯型；當α＝0，β≠0時，產物形成與細胞生長無關；α≠0，β≠0，產物形成與細胞生長部分偶聯。從圖1可知，多肽的生成屬于生長部分偶聯型。通過數學求解得到積分式：

式中：P 為多肽濃度／mg／mL；P0為初始多肽濃度／mg／mL；α，β 為動力學模型參數；α為與菌體生長率相關的產物形成率；βX為非伴隨菌體生長的產物形成率。

以方程（5）為自定義函數，用SPSS軟件進行非線性擬合，擬合結果如圖3所示。

圖3 多肽濃度試驗值與模型方程擬合曲線

多肽濃度（P）隨時間變化的函數為

式中：P0＝1.974；α ＝1.255；β ＝ -0.023；R2＝0.974。β為負值，說明多肽隨著菌株生長而減少，分析其原因為菌株分泌的蛋白酶將菜籽多肽進一步水解成游離氨基酸，導致多肽含量的降低，從圖1中可知游離氨基酸濃度從32 h后急劇升高，因此模型準確。從圖3中可知方程（6）與試驗所得數據能很好地擬合，較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態發酵過程多肽生成情況。

2.4 底物蛋白消耗動力學

在枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕過程中，菜籽粕中的蛋白主要用于菌株生長、多肽生成、游離氨基酸生成和細胞的維持，多肽和氨基酸的生成是由于菌株生長過程中釋放的酶作用于蛋白而生成，可看成菌株生長的一部分，故蛋白消耗可用于Luedeking-Piret方程相似的方程式表示見式（7）。

通過數學求解得到積分式：

式中：S為底物蛋白剩余量／×100 mg；S0為初始底物蛋白剩余量／×100 mg；Yx／s為底物用于菌體生長的得率常數；ms為微生物維持常數。

以方程（8）為自定義函數，用spss軟件進行非線性擬合，擬合結果如圖4所示。

底物蛋白消耗量（S）隨時間變化的函數為

式中：S0＝14.316；Yx／s＝0.858；ms＝0.013；R2＝0.968。

從圖4中可知方程（9）與試驗所得數據能很好的擬合，較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態發酵過程底物蛋白消耗情況。

圖4 底物蛋白消耗試驗值與模型方程擬合曲線

2.5 模型驗證

根據試驗數據，通過SPSS軟件模擬所得枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕動力學模型參數值見表1。

表1 動力學模型參數

為了所得模型能很好的描述正常發酵過程中菌體生長、多肽生成和基質蛋白消耗，在本試驗條件下進行其他發酵試驗組，實測值與模型預測值比較結果見表2。從表2可以看出，模型計算值與實測值的相對誤差絕大部分低于10%，擬合情況良好。雖然發酵前期（6～14 h）多肽生成模型方程曲線值與實測值誤差達到10%以上，但此時多肽濃度及變化不大，對以后菌體的生長及發酵結果影響不大，因此該發酵動力學模型方程能較好地反應枯草芽孢桿菌正常液態發酵菜籽粕的發酵過程。

表2 試驗值與模型計算值的比較

3 結論

3.1 通過對枯草芽孢桿菌正常液態發酵菜籽粕發酵特征的分析，以及構建Logistic和Luedeking-Piret方程，建立了描述發酵過程中菌體生長、多肽生成和基質蛋白消耗的動力學模型，經模型驗證試驗情況良好。本研究創新性地提出了復雜體系發酵底物中的某種成分消耗動力學模型研究方法，并通過發酵中與該成分相關的代謝產物來推出該成分在發酵中的消耗情況，對以后復雜發酵底物的某種成分消耗動力學的研究具有重要的參考價值。

3.2 本研究是在枯草芽孢桿菌正常發酵條件下，但微生物發酵過程的復雜性和影響因素的多變性，使所得發酵動力學模型不能完全反映實際生產中的微生物發酵過程。因此，在今后實際應用中需要對實際發酵過程進行多次優化以及對所建模型進行修正和補充，使模型更好更準確地對實際發酵過程進行預測和控制。

3.3 就本試驗而言，8～28 h是菌體生長對數期，是提高菌體濃度的最佳時期；從32 h以后多肽濃度下降，游離氨基酸大度上升，基質蛋白幾乎耗完，菌體不再生長。結合動力學模型中微生物維持常數ms較低，用于菌體代謝（包括多肽的生成）的底物較少，因此如果要實現較高的菌體濃度和產肽水平可考慮采取中期（32 h左右）及后期補料。通過發酵動力學的研究，對枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕有了進一步的了解，對以后發酵過程的工藝控制、改進和放大提供了理論指導。

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Study on Kinetics Model of Peptides Production by Liquid-State Fermentation from Rapeseed Meal

He Ronghai Xing Huan Liu Lei Wang Zhiping Ma Haile
（School of Food and Bioengineering，Jiangsu University／Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Product Physical Processing／Jiangsu Province Research Center of Bio-process and Separation of Agri-products，Zhenjiang 212013）

The metabolic characters of Bacillus subtilis in liquid fermentation of rapeseed meal were studied.In the process of batch fermentation，the cell growth curve was S-shaped，protein consumption curve showed anti-S-shaped，and the polypeptide concentration reached the highest 10.2 mg／mL in the stable phase of 32 h.The growth law of the normal liquid fermentation process of Bacillus subtilis was described by the spss matching Logistic equationThe regularity of the formation of polypeptide was described by the Luedeking-Piret equation1.068ln（0.99 ＋0.01e0.226t），and the law of substrate protein consumption was described by the Luedeking-Piret equation＋ 0.566ln（0.99 ＋0.01e0.266t）.The relative error between the calculated and measured values was less than 10% ，which reflected the dynamic characteristics of the batch fermentation process of Bacillus subtilis.

bacillus subtilis，kinetic model，liquid-state fermentation，rapeseed meal

TS229

A

1003-0174（2016）09-0069-06

國家十二五科技支撐計劃（2013BAD10B03），國家星火計劃（2014GA690262），江蘇省自然科學基金（BK2012708），江蘇省農產品物理加工重點實驗室開放基金（JAPP2010-9）

2015-01-14

何榮海，男，1971年出生，教授，農產品深加工