恩施魚塘壩玉米硒富集及玉米肽抗氧化活性研究

王 馳 何 慧 張久亮 侯 燾 石 文 劉維維

恩施魚塘壩玉米硒富集及玉米肽抗氧化活性研究

王 馳 何 慧 張久亮 侯 燾 石 文 劉維維

（華中農業大學食品科學技術學院環境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070）

為了探究恩施魚塘壩地區硒資源的分布特點，土壤因素對玉米中硒含量的影響以及硒含量和玉米肽（CPs）抗氧化活性的關系，本文采用玉米良種（湘玉十號），在魚塘壩附近選取16個不同地點種植，并分兩季采收，利用原子熒光法對玉米中蛋白質、多糖中硒含量進行分析，同時對種植地土壤樣本的硒含量和pH值進行了測定。通過HepG2人體肝癌細胞模型對高硒CPs以及低硒CPs的抗氧化活性進行研究。結果表明：所有玉米種植地土壤均達到富硒土壤標準（0.4 mg／kg），但其生長的玉米中硒含量存在較大差異，玉米對硒的富集受到土壤硒含量、種植時間以及pH值的共同影響；玉米中蛋白和多糖具有很高的硒含量。高硒玉米和低硒玉米制成的玉米肽均表現出較好的抗氧化能力，但前者顯著高于后者（P＜0.05），在HepG2細胞抗氧化模型中，500μg／mL濃度為玉米肽最佳抗氧化濃度；與較低硒玉米肽處理組相比，經高硒玉米肽預處理的細胞存活率增加了24.16%。綜上所述，pH低于5的土壤對玉米吸收硒的能力有嚴重抑制作用，弱堿性土壤更適合玉米對于硒的利用，且種植時間較長的老玉米硒含量更高；富硒玉米肽的抗氧化能力顯著高于低硒玉米肽。

魚塘壩 富硒玉米 玉米肽 抗氧化活性 土壤

硒作為人體必需的微量元素之一，是人體內多種硒蛋白的必需成分，具有抗癌［1］、提高自身機體免疫力［2］、預防心腦血管疾病［3］、抗氧化［4-5］等多種生理功能。

土壤是植物硒的主要來源。世界衛生組織公布的資料表明，全世界有40多個國家和地區不同程度的缺硒，我國大約2／3的地區屬于缺硒或低硒地區，其中30%左右的地區嚴重缺硒。湖北恩施享有世界硒都的美譽，魚塘壩是恩施標志性的高硒地區之一［6］。有報道指出，玉米中硒含量與土壤硒含量之間表現出極顯著正相關關系［7］，本實驗室此前對富硒玉米肽（CPs）結構、活性等展開過一系列研究［8-10］，其原料也主要產自該地區，但不同批次玉米間硒含量仍然存在一定差異，故玉米中硒含量與土壤之間的關系還有待進一步研究。另一方面，有研究表明玉米肽具有良好的清除羥基自由基的能力、清除DPPH自由基的能力和還原能力［11-13］，而硒本身作為一種具有抗氧化活性的物質在玉米肽中發揮的作用還有待研究。本研究采用玉米良種，在魚塘壩附近選取不同地點種植并分兩季采收，通過對玉米籽粒以及土壤中硒含量的分析，探究魚塘壩地區硒資源的分布特點，土壤和季節因素對玉米中硒含量的影響，并通過細胞模型對高硒CPs以及低硒CPs的抗氧化活性進行比較，為富硒CPs的深入開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米品種選取湘玉十號，于湖北恩施魚塘壩附近地區定點種植，統一采收。

HepG2人肝癌細胞系：華中科技大學同濟醫學院藥學院；堿性蛋白酶（Alcalase 3.0T）：丹麥諾維信公司；培養基DMEM：美國Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶：美國Amresco公司。

Multiskan Go全波長酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；超濾膜系統（截留相對分子質量為5 000）：美國Millipore公司；細胞培養板／瓶：美國Cellstar Greiner Bio公司；AFS-8220型原子熒光光度計：北京吉天儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米和土壤樣本獲取

在湖北恩施魚塘壩地區9平方公里范圍內選取16處玉米種植地如表1所示（每處種植地之間至少間隔500 m），采用湘玉十號玉米品種于5月中旬播種，當年8月和10月分2次采收（嫩玉米、老玉米）。采收后的新鮮玉米曬干至恒重后剝下玉米粒，于-20℃保存備用。

表1 玉米樣品產地和批次

各玉米種植區域采用多點取樣法，隨機均勻采集土壤樣本，除去枯枝敗葉、石礫等雜質，充分混勻，自然干燥至恒重后研磨、過篩，放入統一密封袋中，于-20℃保存備用。

1.2.2 玉米蛋白的提取

采用本實驗室建立的堿醇提取、等電點沉淀的方法［10］制備玉米蛋白。

1.2.3 玉米多糖的提取

玉米籽粒→洗凈→烘干→粉碎→過40目篩→取一定量玉米粉→按照料液比1∶20（m／V）加入蒸餾水→60℃下超聲提取50 min→4 000 r／min離心10 min→取上清液，將沉淀再重復提取1次→合并上清液→旋蒸濃縮→將濃縮液與Sevag試劑（氯仿、正丁醇按4∶1混合）按4∶1混合→震蕩混勻后裝入分液漏斗靜置→待溶液分層后取上層溶液，重復加入Sevag試劑混勻靜置，直至分層后液面交界處無白色混懸→加入3倍體積95%乙醇沉淀多糖→4 000 r／min離心10 min，取沉淀→冷凍干燥48 h。

1.2.4 CPs的制備

采用本實驗室建立的最佳堿性蛋白酶水解和超濾方法進行制備：富硒玉米蛋白粉→按料液比1∶35（m／V）加水→沸水浴處理30 min→調溫、調pH至一定溫度和蛋白酶的最適pH 8.00→按酶底比0.6%（E／S，m／m）加入Alcalase堿性蛋白酶→邊攪拌邊不斷加入0.1 mol／L NaOH溶液，以維持pH 8.00不再變化→取出燒杯冷卻至室溫→選用截留相對分子質量為5 000的再生纖維素卷式超濾膜進行超濾分離，膜透過物冷凍干燥48 h，在此工藝條件下，肽回收率為73.32%［10］。

1.2.5 硒含量的測定

樣品前處理：

玉米籽粒→洗凈→烘干→粉碎→過40目篩；凍干后的蛋白、多糖樣品→磨碎→過40目篩；土壤樣品→冷凍干燥48 h→磨碎→過40目篩。

硒含量測定參照GB／T 21729—2008，氫化物發生-熒光光譜法（HG-AFS）定量測硒。

1.2.6 土壤樣本pH值測定

土壤pH的測定參照NY／T 1121第2部分所述方法：將干燥的土壤樣品研磨過篩后，精確稱取10 g（精確到0.01 g）于燒杯中，加入超純水25 mL，用攪拌器攪拌1 min，使其充分混勻，放置30 min后測定。

將pH計電機插入試樣懸浮液中，輕輕轉動燒杯以除去電極的水膜，促使其快速平衡，靜置片刻后按下讀數按鈕，待讀數穩定后記下pH值。

1.2.7 HepG2細胞培養

人肝癌HepG2細胞用含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 U／mL的鏈霉素的DMEM培養基培養，細胞存放在37℃和含5%CO2的培養箱中孵育，呈現出單層貼壁生長。試驗用細胞均處于對數生長期，將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，加入適量含血清的培養基終止消化，取適量細胞懸液接種于培養板或培養瓶。

1.2.8 細胞氧化損傷模型的建立

取對數生長期的HepG2細胞，并調整至約為8×104個／mL，接種于96孔板內，每孔100 μL。在37℃、5%CO2的培養箱中培養12 h，待細胞貼壁后，吸棄上清液。試驗組分別加入不同濃度的H2O2（100～800 μmol／L）100 μL，培養板于37 ℃、5%CO2培養箱中培養2 h，其中空白調零組只添加培養液，對照組為含細胞不加藥組，每組設5復孔，培養結束后，吸棄上清液，每孔加無血清培養液200μL濃度為5 mg／mL的MTT 20μL，繼續培養4 h后，盡可能的吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），室溫下在搖床上震蕩10 min，充分混勻并溶解藍紫色的甲臜顆粒。在酶聯免疫檢測儀上選擇490 nm波長，測定各孔吸光度值A490。試驗重復3次，取平均值，按公式計算：

細胞存活率＝（試驗組A490-空白組A490）／（對照組A490-空白組A490）×100%

1.2.9 統計學處理

運用SPSS 19.0統計軟件進行處理，所有的數據均以X±SD表示，通過組間LSD檢驗對試驗結果進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 玉米及其提取物樣本中硒含量的測定結果

由表2可知，生長于不同地理條件下的玉米硒含量存在較大差異。其中編號為7、8的玉米樣品均未檢出硒。編號為6、8的嫩玉米樣品硒含量在檢測限以下，但老玉米樣品檢出微量硒。嫩玉米中硒含量最高的4號樣品，硒含量為1.061 mg／kg；老玉米中硒含量最高的15號樣品，硒含量為3.944 mg／kg。

表2 不同產地玉米樣本、土壤硒含量以及土壤pH

同時，生長于同一地區的嫩玉米與老玉米因收獲時間不同硒含量存在一定差異，除11號玉米樣品外，其他批次老玉米樣品其硒含量均高于嫩玉米，說明延長種植時間可促進玉米對硒的吸收。但這種促進作用在不同批次玉米樣品也中表現出了較大的差異性，如3號玉米樣品老玉米硒含量相對于嫩玉米僅增加了15.5%，而15號玉米樣品老玉米硒含量相對于嫩玉米增幅達3 692.31%，說明生長時間對不同種植地點玉米其硒含量增幅的影響存在較大差異。

由表3可知，蛋白是玉米中硒含量最高的組分，未檢出硒的玉米樣本其蛋白可檢出少量硒。嫩玉米蛋白中硒含量最高的為4號樣品，其含量硒為11.188 mg／kg；中位數為1號嫩玉米蛋白和16號嫩玉米蛋白樣品，其硒含量分別為1.513 mg／kg和1.476 mg／kg。老玉米蛋白中硒含量最高的為14號樣品，達17.009 mg／kg；中位數為1號老玉米蛋白和16號老玉米蛋白2.295 mg／kg 和1.754 mg／kg。

表3 不同產地玉米蛋白、多糖硒含量

玉米多糖中硒含量少于蛋白硒含量。其中嫩玉米多糖硒含量最高的為4號樣品，其含硒量為4.434 mg／kg；中位數為9號嫩玉米多糖和10號嫩玉米多糖樣品，其硒含量分別為0.158 mg／kg和0.160 mg／kg。老玉米多糖中硒含量最高的為14號樣品，其硒含量為7.763 mg／kg；中位數為5號老玉米多糖和16號老玉米多糖樣品，硒含量分別為0.987 mg／kg 和0.872 mg／kg。

總體而言，老玉米蛋白硒和多糖硒含量高于嫩玉米，且玉米中蛋白硒含量、多糖硒含量與總硒的變化趨勢較為一致，蛋白硒和多糖硒較高的樣品總硒含量也較高，反之亦然。說明在不同產品批次中硒在蛋白和多糖中的賦存比例較為一致。相對于玉米籽粒而言，玉米蛋白和多糖均具有很高的含硒量，且玉米蛋白相較于多糖硒含量更高，提取更容易，故硒蛋白及以其為原料制備的硒多肽將是玉米中最具開發潛力的含硒生物活性物質。

2.2 土壤樣本中硒含量和pH值測定結果

由表2可知，不同玉米種植地區土壤樣本硒含量也存在一定差異，但其波動性比玉米中硒含量波動性小，5號地區土壤硒含量最高，為7.571 mg／kg，2號地區土壤硒含量最低，為0.800 mg／kg。富硒土壤標準為含量大于0.4 mg／kg［14］，據此可知本研究采集的全部土壤樣本都達到了富硒土壤標準。

如表2所示，土壤樣本pH大多偏酸性，僅2、4、14共3個土壤樣本呈弱堿性。從表3可知，土壤pH與土壤硒含量之間并無明顯關系，但pH可能影響土壤中硒的存在形式［15］、土壤肥力、微生物活動、有機質的分解與合成等，從而影響玉米對硒的吸收。為了進一步研究土壤因素對玉米中硒含量的影響，現計算與土壤樣品一同采集的16批老玉米樣品的硒富集系數并作圖（圖1）。

圖1 玉米硒富集系數與土壤pH值

由圖1可知，土壤pH與玉米硒富集系數有較強的相關性。其中在2、4、14號3個pH＞7.00的弱堿性土壤樣本上生長的玉米硒富集系數較高，這說明堿性土壤環境有利于玉米對硒的吸收。4號樣品硒富集系數相對于2號和14號偏低可能是由于4號土壤樣本含硒量達5.062 mg／kg，遠高于2號和14號土壤樣本的0.800 mg／kg和1.652 mg／kg的緣故；玉米作為一種非聚硒植物，其對硒的吸收能力有限，最終導致土壤中的硒呈過飽和狀態，故硒富集系數有所下降。對于5、6、7、8、10、11 號土壤樣品，其pH 值在4.58～5.00之間，為所有樣品中土壤酸度最強的批次；而生長在這些土壤樣本上的玉米對硒的富集系數也是所有樣品中最低的；這表明玉米在酸性環境中富集硒的能力受到了嚴重限制。其他pH值在5.00～7.00之間的土壤樣品對應的玉米硒富集系數處于中等水平。

土壤pH是影響玉米硒富集能力的一個重要因素。通常認為適宜玉米生長的土壤pH范圍為5～8。本研究結果表明，可通過對富硒土壤進行適當堿化處理，使玉米中的硒含量大幅提升。不適宜的pH環境對K、Ca、Mg、S、P、N 等玉米生長所需的各種元素的生物有效性均有負面影響，同時還可能影響土壤性質、土壤微生物的活動、肥料的利用率以及作物對養分的吸收［16］。另一方面，硒在土壤中的存在形式也是影響植物吸收的一個重要因素，土壤中的硒是以無機化合物的形式被植物吸收利用的。其中Se6＋和Se4＋都是植物較易于吸收的形式，但Se6＋因具有較高的可溶性，更易被植物利用。在酸性與中性條件下，硒主要以Se4＋形式存在。有研究表明，Se4＋在酸性至近中性的土壤中易與鐵結合，形成難溶的復合物，這種復合作用會隨著pH的升高而降低，從而釋放出更多的Se4＋［15］。同時，隨著pH值的升高，更多的硒被氧化成Se6＋形式，從而使硒的生物利用率大幅增加。因此，就提高玉米中硒的含量而言，必須選擇土壤弱堿性且土壤中硒含量達到富硒標準的種植地。

2.3 CPs抗氧化活性

2.3.1 H2O2處理對HepG2細胞損傷的量效關系

如圖2所示，用100～800 μmol／L H2O2處理HepG2細胞2 h后，細胞存活率分別為86.65%、66.96%、66.31%、63.60%、60.91%，且H2O2濃度在200～600μmol／L范圍內細胞存活率變化趨于平緩，故本研究采用400μmol／L H2O2處理作為細胞氧化損傷模型。

圖2 不同濃度H2 O2作用2 h對HepG2細胞存活率影響

2.3.2 CPs預處理對H2O2誘導HepG2細胞損傷的保護作用

為了研究高硒和低硒CPs預處理對于細胞氧化損傷的保護作用，本研究選用從恩施地區采集的樣品中硒含量最高（17.009 mg／kg）和最低（0.002 mg／kg）的2組蛋白樣品制成的CPs在H2O2損傷前先對HepG2細胞進行24 h預處理，結果如圖3所示。

由圖3可知，經不同濃度CPs預處理后的HepG2細胞存活率均有一定程度的上升，并表現出良好的量效關系。其中200、500、800μg／mL劑量的高硒CPs和500μg／mL劑量的低硒CPs均能極顯著（P＜0.01）提高細胞存活率，且高硒CPs和低硒CPs組最佳預處理濃度均為500μg／mL。在有效濃度范圍內，相同劑量下的高硒CPs相對于低硒CPs細胞存活率有顯著提升（P＜0.05），其中500μg／mL高硒CPs組細胞存活率提升達24.16%，說明硒對玉米肽的活性有增效作用。

圖3 不同濃度CPs預處理對H2 O2損傷HepG2細胞的影響

3 結論

生長在魚塘壩附近不同區域的玉米硒含量存在較大差異，提前收獲的嫩玉米硒含量少于老玉米。玉米蛋白和多糖中硒含量均很高，具有良好的開發利用潛力。本試驗中16批玉米種植地土壤樣本均達到富硒土壤標準（＞0.4 mg／kg），但大部分土壤偏酸性，僅3批土壤樣本呈弱堿性。土壤酸堿性影響玉米的硒富集能力有重大影響。酸性至近中性土壤不利于玉米對硒的吸收，玉米在弱堿性土壤中表現出對硒良好的吸收能力。高硒玉米和低硒玉米制成的玉米肽均表現出較好的抗氧化能力，在HepG2細胞抗氧化模型中500μg／mL濃度為玉米肽最佳抗氧化濃度，且高硒玉米肽抗氧化活性顯著高于低硒玉米肽，在該濃度下，經過高硒玉米肽預處理的細胞存活率增加了24.16%。

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Study on Selenium Enrichment of Corn in Yutangba，Enshi and the Antioxidant Activity of the Corn Peptides

Wang Chi He Hui Zhang Jiuliang Hou Tao Shi Wen Liu Weiwei
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Environment Correlative Dietology Ministry of Education，Wuhan 430070）

In order to study the distributional characteristic of selenium in Yutangba，Enshi，the effects of soil on the selenium content of corn and the relationship between the selenium content and the antioxidant activity of corn peptides，the fine maize variety Xiangyu No.10 was chosen to be planted in 16 places near Yutangba and be collected in 2 seasons.Then，the selenium content of the corn，protein and polysaccharide in these corns was analyzed by the atomic fluorescent spectrometry.The selenium content and pH value of the soil samples collected from the cultivated fields were measured at the same time.The antioxidant capacities of high selenium CPs and low selenium CPs were researched according to the HepG2 body hepatoma cell model.The results showed that all the soil samples were up to the standard of selenium-enriched soil（0.4 mg／kg），however，the selenium content of the corns planted on these soils were quite different between each other，the selenium content，growing time and the pH value of the soil had combined impacts on the selenium enrichment of corn，and protein and polysaccharide in the corn had high selenium content.The corn peptides made by high selenium corn and low selenium corn showed a good antioxidant ability.While the former was significantly stronger（P ＜0.05），in the HepG2 cell model，the optimum antioxidant concentration of corn peptide was500 μg／mL；compared to processing group of lower selenium corn peptide，the cell viability preprocessed by high selenium corn peptide increased by 24.16%.In conclusion，the soil whose pH was below 5 had severe inhibiting effect on ability of corn absorbing selenium，the slightly alkaline soil was more suitable for the corn using selenium.The corns harvested later had a higher content of selenium；the antioxidant ability of corn peptides with high selenium level was significantly stronger than the ones with lower selenium level.

Yutangba，selenium-enriched corn，corn peptides，antioxidant activity，soil

Q514

A

1003-0174（2016）09-0075-06

國家自然科學基金（30972043），中央高校基本科研業務費專項（2013PY095）

2015-01-15

王馳，男，1990年出生，碩士，食品化學

張久亮，男，1982年出生，副教授，天然活性成分研究與開發