寇氏隱甲藻發酵產DHA藻油的動力學模型研究

王 澍 曹 維 付 杰 田 華 陳 濤 何東平

寇氏隱甲藻發酵產DHA藻油的動力學模型研究

王 澍1曹 維1付 杰1田 華1陳 濤2何東平1

（武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023）
（中國科學院武漢病毒研究所2，武漢 430071）

本文利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程對寇氏隱甲藻發酵產DHA藻油動力學進行研究。通過測定寇氏隱甲藻在50 L發酵罐中生物量、油脂產量、DHA產量、葡萄糖濃度的變化，建立了菌體生長、產物形成和基質消耗的動力學模型，同時對試驗值與模擬值進行了比較，平均相對誤差大部分小于10%。通過對發酵過程的曲線擬合以及模型參數的計算，模型相關指數分別為：0.993、0.996和0.978，模型模擬計算結果與試驗值能較好地吻合，說明所建立的發酵動力學模型能夠較好地反映寇氏隱甲藻的發酵過程，為其工業化生產提供科學依據。

寇氏隱甲藻 動力學模型 Logistic方程 Luedeking-Piret方程

二十二碳六烯酸（DHA）是一種ω-3系多不飽和脂肪酸（PUFA）。近年來，DHA因對人體健康的突出作用而備受關注。DHA市場需求量的增大，使得利用海洋微藻和真菌發酵生產DHA藻油成為當前新途徑［1-4］。在眾多海洋異養甲藻中，寇氏隱甲藻現已被確定為DHA的高產藻種之一，可在沒有光照的條件下發酵培養，從而實現細胞的增長和油脂的積累，其細胞生產的大量油脂中DHA的含量遠高于其他多不飽和脂肪酸，可以說寇氏隱甲藻在生產DHA藻油方面具有極大優勢［5-8］。

在菌種的發酵生產過程中，菌體生長、產物積累和底物消耗是最為關鍵的幾個因素。發酵前期的菌體生長和發酵中后期的產物的積累都取決于發酵液中底物濃度。而產物的積累同時也取決于菌體生長狀況。通過對發酵過程的動力學模型進行研究，可以了解發酵過程底物、菌體生長和產物積累的相關關聯關系，可以預測發酵進行的程度，估算底物消耗速率，了解產物生成情況［9-10］。

由于Logistic方程和Luedeking-Piret方程能很好地反映菌體生長以及產物形成等情況，且在分批發酵中應用非常廣泛，所以決定采用這2種方程建立模型。在寇氏隱甲藻發酵的不同時間段取發酵液樣品進行菌體生物量、油脂產量和葡萄糖濃度的測定，對發酵過程進行分析后，用Logistic方程和Luedeking-Piret方程，建立起寇氏隱甲藻發酵過程中菌體生長、產物形成和基質消耗的動力學模型。為寇氏隱甲藻產DHA藻油工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

ATCC30772寇氏隱甲藻株：廣東微生物菌種保藏中心；2.4k-2A2-5寇氏隱甲藻突變株：經過2次60Co-γ射線誘變獲得，本實驗室保存［11］。

1.2 試劑

葡萄糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；谷氨酸鈉：上海如吉生物科技發展有限公司；硫酸鎂：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈷：天津市恒興化學試劑制造有限公司；正己烷：天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、氯化鈣：天津市凱通化學試劑有限公司；無水乙醇：天津天力化學試劑有限公司；纖維素酶（10～140萬U／g）、堿性蛋白酶（20萬U／g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；所用的試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

GRJ-50B型發酵罐：鎮江格瑞生物工程有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LDZX-75KB立式蒸汽滅菌器：武漢利天科技儀器有限公司；RE-52C旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 培養條件

種子培養：從長好藻種的斜面上取一定量純的藻落，接種到一級種子培養液中，置于搖床上，pH 6.5，26 ℃、180 r／min 條件下培養48 h。

50 L發酵罐培養：將二級種子液按10%的接種量接種到50 L發酵罐中，28℃培養48 h然后降溫到22℃，通氣量30 L／h，190 r／min條件下培養至放罐。

1.4.2 生物量測定

寇式隱甲藻的生物量以收集的藻體細胞干重計。取一定體積的培養液裝入預先稱重的離心管中，5 000 r／min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗3次，置于干燥箱中，45℃條件下烘干，稱重（至恒重）。

生物量＝干菌體質量／發酵液體積

1.4.3 葡萄糖濃度測定

吸取5 mL堿性酒石酸銅甲液與5 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預測體積少1 mL的試樣溶液至錐形瓶中，使在2 min內加熱至沸，保持沸騰繼續以1滴／2 s的速度滴定，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積。同法平行操作3份，得出平均消耗體積（如果樣品殘糖濃度偏低，可先加入一定量的標準葡萄糖溶液，再滴加試樣溶液滴定至終點）。

1.4.4 油脂提取

將濕藻體按濕重∶純凈水為1∶1～1∶3的比例，制成懸浮液，加堿性蛋白酶和纖維素酶，（60±1）℃水浴溫培，同時攪拌8 h，鏡檢藻體破壁后，加入95%乙醇脫水30～60 min，靜置分層，使乙醇-水相與藻泥分層。將乙醇-水相和藻泥分別加入4號溶劑油，分裝2個分液漏斗中，靜置分層。取出上層4號溶劑油藻油相提萃液。反復浸提，至藻泥變白無油為止。把4號溶劑油提萃液經旋轉蒸發，獲得粗藻油，粗藻油經脫膠除雜等過程后獲得金黃色精藻油。

油脂產量＝油脂質量／發酵液體積

1.4.5 DHA產量測定

藻油脂肪酸甲酯化：取0.1 g油樣，加1 mL苯-石油醚（體積比為1∶1）混合溶劑，再加1 mL 0.4 mol／L的氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻，在室溫下靜置8～10 min，然后加蒸餾水使醚層升至頂部，待液層澄清后即可作色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱：Agilent SP-2560（100 m×25μm，0.2 μm）；升溫程序：100 ℃ 保持4 min，以3 ℃ ／min升溫至230 ℃，保持20 min，載氣（N2）流速25 mL／min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL；分流比15∶1。

DHA產量＝油脂產量×DHA含量

1.4.6 數據處理

用所得數值在Logistic方程和Luedeking-Piret方程的基礎上，建立寇氏隱甲藻發酵過程中菌體生長、基質消耗、產物形成的動力學模型。應用Orige 8.5軟件處理試驗數據和模型，擬合出所有模型參數，建立發酵動力學數學模型。

2 結果與分析

2.1 寇氏隱甲藻發酵

寇氏隱甲藻發酵過程曲線如圖1所示。寇氏隱甲藻的生物量、油脂含量、DHA產量、葡萄糖濃度隨發酵時間的延長而變化。在最佳發酵條件的基礎上，進行發酵代謝過程研究，發酵時間設定為120 h。發酵0～24 h為生長延遲期，菌體濃度增長緩慢，油脂和DHA開始積累。發酵24～96 h為對數期，菌絲體生長迅速，還原糖大幅度下降，油脂和DHA快速積累。發酵96 h后，菌體的生物量和DHA產量基本趨于穩定，菌體生物量在120 h時達到最大值為61.30 g／L，此時，菌體中油脂產量高達27.31 g／L。由圖1可知，其油脂合成和菌體生長呈部分相關。

圖1 寇氏隱甲藻的發酵過程曲線

2.2 寇氏隱甲藻生長模型

菌體生長動力學最常用方程有Mond方程和Logistic方程［12］。由于Mond方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一個典型的S型曲線，能很好地反映發酵過程中普遍存在的菌體濃度增加對自身生長的抑制作用，所以采用Logistic方程構建菌體生長動力學模型較為合適，Logistic方程為：

以方程（2）對圖1中的菌體生物量試驗值進行非線性擬合，可以求得參數μmax＝0.112，Cx，o＝0.54，Cx1max＝61.30，代入方程（2）可得：

根據試驗結果，以菌體生物量Cx對生長時間t作圖。從圖2可知，該模型的擬合值和試驗值基本一致，相關系數R2＝0.993，說明此模型能較好地反映寇氏隱甲藻的生長過程。

圖2 菌體生長的發酵試驗值與模型擬合值的比較

2.3 產物形成模型

由圖1可以看出油脂的合成與菌體生長沒有直接相關性，即油脂的合成與菌體生長屬于部分耦聯關系，因此選用Luedeking-Piret方程來描述寇氏隱甲藻發酵過程中油脂合成規律，它可以同時反映與菌體生長耦聯的產物形成的速率，也可反映獨立于菌體的通過細胞催化形成產物的速度，該模型可以適用于一般的發酵過程，即：

式中：α，β為模型參數，P為油脂質量分數／%，當t＝0時，P0＝0。

將方程（1）代入方程（4）得：

把方程（2）代入方程（5）積分得：

以方程（6）進行擬合，求得方程參數α＝0.269 7，β ＝0.002 5，代入方程（6）中，寇氏隱甲藻發酵過程中油脂合成模型如下：

從圖3可知，該模型的擬合值和試驗值基本吻合，模型的相關系數R2＝0.996，說明此模型較好的反映了寇氏隱甲藻發酵過程中的油脂積累過程。

圖3 菌體發酵過程中油脂產量試驗值與模型擬合值的比較

2.4 底物消耗模型

菌體發酵過程中，底物的消耗一方面用于細胞的增殖，另一方面則用于產物的合成及其代謝，因此，底物消耗速度可由Luedeking-Piret-Like方程表示：

式中：Yx／s為對底物菌體生長的得率系數，g（菌體干重）／g（葡萄糖）；Yp／s為對底物產物的得率系數，g（產物）／g（葡萄糖）。ms為葡萄糖用于維持細胞生命常數，g（葡萄糖）／g（菌體干重）／h。

將方程（1）、方程（4）代入方程（8）中，積分整理可得：

按方程（9）對發酵過程中的葡萄糖濃度試驗值進行非線性擬合，得到基質消耗量關于時間的方程：

根據方程（10）將模型擬合值和實際值進行比較（見圖4），除個別點外，擬合值和實際值基本吻合，模型的相關系數R2＝0.978，說明此模型能較好反映寇氏隱甲藻的底物消耗過程。

圖4 菌體發酵過程中底物消耗試驗值與模型擬合值的比較

2.5 模型驗證

為了檢驗模型誤差，在同等發酵條件下進行3個批次試驗，所得數據取平均值，與動力學模型的模擬值進行比較，得出細胞生長、油脂形成及葡萄糖消耗的理論值與試驗值的平均相對偏差分別為4.04%、3.66%和4.57%。寇氏隱甲藻發酵動力學模型的誤差檢驗的詳細結果見表1。

表1 試驗值與預測模擬值的比較

由表1可知，模型預測值與試驗值符合得較好，平均相對誤差大部分小于10%。該結果表明，所建立的動力學模型能較好的描述寇氏隱甲藻發酵過程中菌體生長、產物形成及底物消耗的變化規律。

3 結論

微生物反應過程是非常復雜的體系，關系到發酵培養基中的營養成分、培養溫度、通氣量等條件，對其進行精確描述幾乎是不可能的。因此，在發酵過程中建立機制模型要進行合理的簡化，采用均衡生長的非結構模型。即在細胞的生長過程中，細胞內各種成分均以相同的比例增加，菌體為單組分，不考慮環境對菌體組成的影響，采用較為簡化的方式，對關鍵變量進行考慮，忽略次要因素，并據此建立較為簡便，便于分析驗證，易實現計算自動化的數學模型［13-14］。

研究結果表明，在發酵前期，油脂的增長趨勢明顯滯后于菌體細胞生長，此時葡萄糖消耗不大，但底物消耗的模擬值與試驗值有較小的偏差，可能是發酵初期，罐內攪拌不均勻導致的。菌體細胞生長進入穩定期后，生物量快速增長，葡萄糖的大量消耗使得油脂產量顯著提高，當生物量趨于穩定時，油脂繼續合成，由此認為寇氏隱甲藻發酵生產DHA藻油分為菌體生長和產物合成2個階段，產物合成屬于部分生長耦聯型。

通過對發酵過程的曲線擬合以及模型參數的計算，模型相關指數分別為：0.993、0.996和0.978，說明所構建的模型與實際生長情況吻合度較好，模型的計算結果在一定程度上揭示了寇氏隱甲藻發酵代謝的動力學特征，可用來預測發酵體系中產物的合成和底物的濃度，制定補料工藝，優化發酵工藝參數，實現發酵過程的集約化，為工業化生產提供參考。

［1］姜劍鋒，趙麗芹，陳濤，等.寇氏隱甲藻不同破壁方法的研究［J］. 中國糧油學報，2011，26（8）：92-94，99

Jiang Jianfeng，Zhao Liqin，Chen Tao，et al.Study on Different Wall-broken Methods for Crypthecodinium Cohnii［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2011，26（8）：92-94，99

［2］Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used forsingle cell oil production［J］.Biochimie，2004，86（11）：807-815

［3］王澍，張靜雯，呂小義，等.寇氏隱甲藻突變株發酵條件的響應面優化［J］.中國釀造，2014，33（9）：71-74

Wang Shu，Zhang Jingwen，Lü Xiaoyi，et al.Optimization of fermentation conditions of Crypthecodinium cohnii for DHA production with response surface methodology［J］.China Brewing，2014，33（9）：71-74

［4］Ana Mendes，Alberto Reis，Rita Vasconcelos，et al.Crypthecodinium cohnii with emphasis on DHA production：a review［J］.Journal of Applied Phycology，2009，21（2）：199-214

［5］Swaaf MD，Pronk J，Sijtsma L.Fed-batch cultivation of the docosahexaenoic-acid-producing marine alga Crypthecodinium cohnii on ethanol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2003，61（1）：40-43

［6］郭小婧，龔陽敏，梁焯，等.溫度和碳源對隱甲藻生長及DHA積累的影響［J］.中國油料作物學報，2013，35（5）：597-603

Guo Xiaojing，Gong Yangmin，Liang Zhuo，et al.Effects of temperature and carbon source on growth and docosahexaenoic acid accumulation of Crypthecodinium cohnii［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2013，35（5）：597-603

［7］趙書林，何東平，陳濤，等.寇氏隱甲藻突變株的糖、氮代謝對產油的影響［J］. 中國糧油學報，2014，29（11）：65-69

Zhao Shulin，He Dongping，Chen Tao，et al.The effects of sugar and nitrogen metabolism on oil production by mutant strains of crypthecodinium cohnii［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2014，29（11）：65-69

［8］王菊芳.隱甲藻Crypthecodinium cohni培養生產DHA的優化及調控研究［D］.廣州：華南理工大學，2000

Wang Jufang.The production of DHA optimization and regulation research of Crypthecodinium cohnii［D］.Guangzhou：South China University of Technology，2000

［9］張志東，王瑋，茆軍，等.低溫淀粉酶發酵動力學模型的研究［J］. 食品科學，2009，30（3）：137-140

Zhang Zhidong，Wang Wei，Mao Jun，et al.Study on fermentation kinetics for cold-active amylase production by Bacillus LA7［J］.Food Science，2009，30（3）：137-140

［10］張大為，呂嘉櫪.嗜酸乳桿菌WS所產細菌素生物學特性的研究［J］. 食品工業科技，2005，171（7）：70-71

Zhang Dawei，Lü Jiali.Study on the biological characteristics of bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus WS［J］.Science and Technologyof Food Industry，2005，171（7）：70-71

［11］佘雋，田華，陳濤，等.高產DHA的寇氏隱甲藻突變株的篩選［J］. 食品科學，2013，34（17）：230-235

She Jun，Tian Hua，Chen Tao，et al.Screening of highyield DHA-producing Crypthecodinium cohnii mutant［J］.Food Science，2013，34（17）：230-235

［12］藏榮春，夏風毅.微生物動力學模型［M］.北京：化學工業出版社，2003

Zang Rongchun，Xia Fengyi.Microbial dynamics model［M］.Beijing：Chemical Industry Press，2003

［13］聶國興，宋東鎣，明紅，等.黑曲霉C71分批發酵動力學模型的構建［J］.河南師范大學學報（自然科學版），2010，38（2）：148-155

Nie Guoxing，Song Dongying，Ming Hong，et al.Kinetics models of batch fermentation for xylanase by Aspergillus niger C71［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science），2010，38（2）：148-155

［14］馮沖，李領川，趙國欣，等.玉米秸稈水解液發酵產微生物油脂動力學研究［J］. 中國糧油學報，2012，27（10）：13-16

Feng Chong，Li Lingchuan，Zhao Guoxin，et al.Dynamics study on microbial oils production by corn straw hydrolysate fermentation［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2012，27（10）：13-16.

Study on Fermentation Kinetics for DHA Algae Oil Production by Crypthecodinium Cohnii

Wang Shu1Cao Wei1Fu Jie1Tian Hua1Chen Tao2He Dongping1
（School of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（Wuhan Insitute of Virology，Chinese Academy of Sciences2，Wuhan 430071）

The fermentation process of DHA algae oil production by Crypthecodinium Cohnii was studied，based on Logistic equation and Luedeking-Piret equation.The biomass，the yield of oil and DHA and change of glucose concentration were determined using Crypthecodinium Cohnii in 50 L fermentation tank，based on which the kinetic models for thallus growth，oil production and substrate consumption were established，and the predictive values of models were compared with the experimental data，as a result，the average relative errors were less than 10%.Through the calculation of fermentation process curve fitting and model parameters，the related index of the model were 0.993，0.996 and 0.978，respectively，which showed they matched well.The result showed that the models could provide a reasonable description for the fermentation process of Crypthecodinium Cohnii，thus providing a theoretical basis for the industrial production of DHA.

Crypthecodinium cohnii，kinetic models，logistic equation，luedeking-piret equation

Q93-335

A

1003-0174（2016）09-0081-05

糧食公益性行業科研專項（201313012-03），十二五國家科技支撐計劃（2011BAD02B00）

2015-01-04

王澍，男，1989年出生，碩士，微生物油脂

何東平，男，1957年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白